Génotypage rhésus D fœtal à partir du sang maternel : apports et limites > J.M. COSTA Laboratoire PASTEUR CERBA Paris le 7 novembre 2008

Génotypage rhésus D fœtal Conflits d’intérêts déclarés JM Costa Laboratoire Pasteur Cerba (Privé): salarié Laboratoire LFB (Rhophylac®): aucun Institut Jacques Boy (Free DNA fetal kit®RhD): aucun

Diagnostic prénatal à partir du sang maternel L’ADN fœtal sérique ou plasmatique  (ADN fœtal libre circulant) Cellules fœtales circulantes 

Diagnostic prénatal à partir du sang maternel ADN fœtal libre: difficultés et limites d’analyse Ne représente que 3 à 6% de l’ADN plasmatique Analyse restreinte aux séquences « paternelles »

Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au génotypage RHD Les bases moléculaires du phénotype RhD-négatif + 42% + Phénotype RhD-positif 85% + 43% del del Phénotype RhD-négatif 15% del

Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel: principe Détection par amplification génique (PCR en temps réel) de séquences nucléotidiques (d’origine paternelle) dérivées du gène RHD Génome paternel RhD-positif Ex5 Ex7 Ex10 Sang maternel Génome maternel + Génome foetal Fœtus RhD-positif Génome maternel + Génome foetal Fœtus RhD-négatif

Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel: principe Les bases moléculaires du système rhésus Sensibilité + ++ +++ Ex5 Ex7 Ex10 Allèle RHD+ + + + Caucase Afrique noire Allèle RHD Neg « classique » 99% 18% - - - Allèle RHD- « RHD-CE-Ds» <1% 15% - - + Allèle RHD- « RHD» <1% 67% - + + Fréquence du phénotype RhD-négatif: 15-17% 3-5%

Principe du génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Les limites  Génome paternel RhD-positif Ex5 Ex7 Ex10 Sang maternel Génome maternel + Génome foetal Fœtus FAUX-Positif 

Principe du génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Les limites Génome paternel RhD-positif Ex5 Ex7 Ex10 Sang maternel  Génome maternel + Génome foetal Fœtus ? « Unconclusive result »

Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Les limites: aucun test ne sera jamais parfait Les « unconclusive results » variants du gène RHD chez la mère Les faux-positifs variants du gène RHD chez le foetus Procédure de laboratoire (contaminations) Vanishing twin Les faux-négatifs Procédure de laboratoire (défaut de sensibilité) variants du gène RHD Injection inutile anti-D Risque infectieux  0 (?) Allo-immunisation  13%

Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Expériences récentes en Europe

Pourquoi faut-il proposer le génotypage RHD fœtal ? Recommandation du CNOGF 2005 Intérêts Cà marche ! Limiter l’exposition à des produits dérivés du sang Limiter l’utilisation des immunoglobulines (stocks limités) Augmente la pertinence de la prophylaxie (Jones et al, BJOG 2004;111:8982-902) Pour éviter 1 cas d’allo-immunisation, il faut traiter: 278 femmes en l’absence de génotypage 166 femmes si le génotype fœtal RHD est connu positif

Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Frein à sa généralisation Déficit d’information des patientes et des professionnels Laboratoires Activité de diagnostic prénatal (génétique moléculaire) Autorisation de diagnostic prénatal par l’ARH Praticiens agréés par l’Agence de la Biomédecine Coût du test Remboursement (B700: 189€ par assimilation diagnostic prénatal) suspendu depuis janvier2008 (décision CNAM unilatérale) Sanquin-NL (149€), Pasteur-Cerba-FR (150€), IGBRL-UK (279€) Haute Autorité de Santé saisie début 2008 Intérêt économique incertain

Intérêt économique du génotypage RHD foetal systématique? Etude pilote: A.Benachi, N Léticée N, JM Jouannic JM, Y Ville, JM Costa Hôpital Necker-Paris, CHI Poissy, Hôpital Trousseau, Hôpital Américain de Paris Suivi de 101 patientes RhD négatives (Caucase.93, Afr.Nord7, Antilles 1) Génotypage fœtal non interventionnel au premier trimestre: terme moyen 13SA Pas de prophylaxie systématique à 28SA Décompte: RAI, Test de Kleihauer, Groupe, Rhophylac, Soins infirmiers Résultats Génotypage RHD fœtal 2 résultats « unconclusive » (Caucase1,Antilles1) 75 patientes à risque (fœtus RHD-positif) 24 patientes avec fœtus RHD-négatif (25%) Prophylaxie ciblée: 23 patientes 12 amniocentèses 11 saignements et traumatismes

Evaluation des coûts: impact de la prophylaxie systématique 1 Coût moyen par patiente: 242€ Coût moyen par patiente: 331€ (+36.8%) 2 Prévention ciblée Prévention ciblée+systématique Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Conjoint (à documenter) Détermination du groupe rhésus Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé NNé RhD-négatif NNé RhD-Positif NNé RhD-négatif NNé RhD-Positif Anti-D 200µg Test de Kleihauer Anti-D 200µg Test de Kleihauer

Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage? 1 Coût moyen par patiente: 242€ Coût moyen par patiente: 331€ (+36.8%) 2 Prévention ciblée Prévention ciblée+systématique Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage 22€/test 464€ si génotypage 150€/test 599€ si génotypage 279€/test Génotypage RHD foetal 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique X Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé A titre de repère Test de Kleihauer 19€ PCR Chlamydia UR 27€ PCR Toxo LAMN 169€ NNé RhD-négatif NNé RhD-Positif Anti-D 200µg Test de Kleihauer Test commercial RHD en duplicate 104€

X X Quelle stratégie? 1 2 Coût moyen par patiente: 242€ 331€ (+36.8%) 2 Prévention ciblée Prévention ciblée+systématique Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage 22€/test 464€ si génotypage 150€/test 599€ si génotypage 279€/test De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois Génotypage RHD foetal 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique X X Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage 46€/test 440€ si génotypage 150€/test 574€ si génotypage 279€/test Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé NNé RhD-négatif NNé RhD-Positif Anti-D 200µg Test de Kleihauer

Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage? 1 Coût moyen par patiente: 242€ Coût moyen par patiente: 331€ (+36.8%) 2 Prévention ciblée Prévention ciblée+systématique Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage 22€/test 464€ si génotypage 150€/test 599€ si génotypage 279€/test Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif Génotypage RHD foetal De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage 87€/test 399€ si génotypage 150€/test 532€ si génotypage 279€/test X 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique X Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé X NNé RhD-négatif NNé RhD-Positif Anti-D 200µg Test de Kleihauer

Quel objectif/quelle stratégie pour le génotypage? 1 Coût moyen par patiente: 242€ Coût moyen par patiente: 331€ (+36.8%) 2 Prévention ciblée Prévention ciblée+systématique Premier trimestre Patiente: Détermination du groupe rhésus Recherche d’agglutinines irrégulières Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage 22€/test 464€ si génotypage 150€/test 599€ si génotypage 279€/test Couple à risque Patiente RhD-négative non immunisée Conjoint RhD-positif Génotypage RHD foetal Taux de Fœtus RHD Neg Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage 87€/test 399€ si génotypage 150€/test 532€ si génotypage 279€/test De 12SA à accouchement Anti-D 200µg: prévention ciblée en cas de situation à risque +/- test de Kleihauer RAI: 6ème, 8ème mois 25% X Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage 110€/test 370€ si génotypage 150€/test 501€ si génotypage 279€/test 27-29SA Anti-D 300µg: prévention systématique X 33% Accouchement Détermination du groupe rhésus NNé X Coût moyen par patiente: 331€ si génotypage 155€/test 319€ si génotypage 150€/test 453€ si génotypage 279€/test NNé RhD-négatif NNé RhD-Positif 50% Anti-D 200µg Test de Kleihauer

Peut-on réduire la demande de génotypage? Phénotypage rhésus CDE du conjoint (B75:25€) + + + del Fœtus RhD-positif  100% Fœtus RhD-positif  50%

Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel Questions à réponses variables ADN fœtal sérique ou plasmatique? Quel délai pour l’acheminement de l’échantillon au laboratoire? Quel test proposé:1ère, 2ème ou 3ème génération? Doit-on contrôler les résultats négatifs? Doit-on contrôler les résultats sur liquide amniotique si amniocentèse? A quel terme? A quelle patiente doit-on proposer le test? Patientes allo-immunisées Patientes devant avoir un geste invasif Toutes les patientes RhD négatives

Test de Kleihauer: contrôle de qualité Simmonet et al. Annales de Biologie Clinique 2001 échantillon C: 50 hématies fœtales/ 10.000 1 2 3 4 5 Nbre d’injections anti-D