Méthylation et métalloïdes toxiques Université Claude Bernard Lyon 1 UMR CNRS 5557 USC INRA 1193 - Symbiose actinorhizienne - Symbiose mycorhizienne - Interactions rhizosphèriques - Transfert de gènes et adaptation bactérienne - Groupes fonctionnelles du cycle de l’azote - Bactéries Pathogènes Opportunistes et Environnement Méthylation et métalloïdes toxiques B. Cournoyer Bâtiment Grégor Mendel - 43, boulevard du 11 novembre 1918 69 622–VILLEURBANNE Cedex tél : 0472431377 - fax : 0472431223

Les voies de méthylation des métalloïdes toxiques plusieurs bactéries pathogènes = résistantes au tellurite et/ou sélénite: - P. syringae, Agrobacterium tumefa ciens - P. aeruginosa, E. coli VTEC, Salmonella typhimurium - Staphylococcus aureus Odeur d’ail réduction K2TeO3 4ppm  Pourquoi? Quel mécanisme? Méthylation?

Les voies de méthylation des métalloïdes toxiques Identification de la bTPMT (Cournoyer, 1996) P. syringae Odeur d’ail = DMTe pSK - pSK - EcoRI HincII EcoRI SmaI HincII PstI EcoRI XhoI 0.92 1.65 T3 LB 1 2 T7 tpmE htpX-like orfC-like E. coli ::tpmE + sélénite K2TeO3 4ppm  E. coli TPMT-E Analyse GC-MS (Ranjard et al., 2000)

Caractérisation de la bTPMT Caractéristique du déterminant: - forte homologie avec la thiopurine méthyle transférase (TPMT) humaine (30% identités; 55% similarités) Gmelin (1824): odorous materials obtained from Se et Te during animal experiments; a garlic-like odour (première observation) - Idem chez l’Homme lors d’intoxication au Se et Te

Métabolisme des thiopurines Fin des années 80, la TPMT est montrée essentielle pour le métabolisme des pro-drogues « 6-mercaptopurine » et « thioguanine nucleotides » Krynetski & Evans, Oncogene, 2003 HPTR: hypoxanthine phosphoribosyltransferase Autres fonctions chez l’Homme - détoxication de métalloïdes???

Suite des travaux sur les bTPMT Introduction de toxiques (As, Se, Te, etc) dans l’environnement Produits volatils observés e. g. DMSe, DMDSe, DMSSe, etc GC-MS DMSe: diméthyle sélénide, DMDSe: diméthyle disélénide, diméthyle soufre sélénium, autres produits: DMSeH Sol (10 g) Présence de bTPMT ??

Détection des gènes de la bTPMT Stratégie mise en place - élaboration d’un crible PCR / utilisation des domaines conservés TPMT-E vs huTPMT (30% identités; 55% similarités) TPMT-E 1 43 78 AA 234 bp 127 216 AA détection de tpm dans les ADN méta-génomiques des sols et des eaux

Diversité des bTPMT A B C D E * F G (eubacteria) H UbiG I J uniquement chez 30% des g-proteobacteria K L M bTPMT N O - plus de 50% de similarités plusieurs allèles par lignée P Q R S T U = sol (7) V X * = b, Bordetella spp. Homme, Rat, Souris UNK TPMT (b et g-proteobacteria) Publication: Favre-Bonté et al., 2005 + ms en cours de rédaction

Affinité des bTPMT pour les métalloïdes Avant Après TPMT-E GST M Avant induction Après induction Extrait soluble TPMT G1 TPMT G2 TPMT G3 Marqueurs 14.4 25 35 45 66.2 116 18.4 kDa TPMT-E TPMT-G Coupure de l’His tag Chromatographie d'affinité : TPMT-G : Ni-NTA (élution par 250 mM imidazole) TPMT-E : Glutathione-Sepharose-4B (élution par 10 mM glutathion)

Affinité des bTPMT pour les métalloïdes Mise au point des tests enzymatiques . tampon de réaction (selon Krynetski et al., 1995) . choix du substrat – 6-mercaptopurine TPMT . Immuno-suppresseur (lors des greffes) . Traitement de la leucémie, et . Maladie auto-immune DO 320 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 10 20 30 40 50 60 DO320 Temps (min) Courbe 1 Courbe 3 Courbe 2 Courbe 4 Courbe 5 TPMT-E TPMT-G1 TPMT-G2 TMPT-G3 Vm (nmol.min-1.mg-1) 5,6 2,4 3 1.3 Km (µM) 81 46 57 20 10 µM TPMT-E Paramètres cinétiques de méthylation de la 6-MP par TPMT-E et les 3-TPMT-G. huTPMT, Km= 10.6 mM Activité de méthylation de la 6-MP

Affinité des formes enzymatiques pour les toxiques séléniés méthylation de substrats séléniés: 6-séléno-purine, Se-cystine, sélénite et séléniate . avec des extraits de protéines totales TPMT+ - obtention de DMSe à partir de Se-cystine - absence d’activités avec le sélénite . en cours, comparaison des affinités et vitesse de réaction entre mercaptopurine et séléno-purine DO 350 SeH

Substrats de la méthyle transférase bTPMT CH3SeCH3 S, Se, Te – inorg. et org. Autres produits: DMS, DMDS, DMDSe DMSeS, DMTe SAM SAH bTPMT bTPMT Thiopurine (anti-métabolites de la synthèse des purines) - utilisation répandue pour le traitement de maladies auto-immunitaires, de la leucémie, du cancer et prévention des rejets d’organes transplantés

bTPMT et l’As? La piste des odeurs Bartolomeo Gosio (1892): obtained a garlic like odor from microbes growing on a potato mash containing arsenic trioxide + Scopulariopsis brevicaulis (Gosio’s fungi): Gosio’s garlic-like gas (TMA) from As mercaptan-like odour (DMSe) from selenite garlic-like odour (DMTe) from tellurite

As dans l’environnement Produits volatils observés - MeAs, DMeAs, Méthylation bactérienne de l’As (en aérobiose) Etat des lieux: E. coli + DMA = TMAO (trimethylarsine oxide) - Nocardia + MMA = (CH3)nAsH3-n (les méthyle arsines) Bactéries TPMT +: Pseudomonas sp. + arséniate = (CH3)2AsH Aeromonas et Alcaligenes + méthyle arsoniate (MMA)= (CH3)AsH2 et (CH3)2AsH As dans l’environnement Produits volatils observés - MeAs, DMeAs, TMeAs « There are apparently no accounts of the characterization of specific arsenic methyltransferases from microorganisms » (Bentley and Chasteen, 2002)

Autres As métalloïdes-méthyle transférases ? Les pistes: 1. Les proches voisins de la TPMT - UbiG (demethylubiquinone methyltransferase) « UNK » (putative methyltransferases) 2. Les UbiE et MMT (métalloïdes méthyle transférases) - Découverte simultanée – nouvelle famille de Se/Te-méthyltransférases UbiE MMT Se-méthylation large distribution plusieurs duplications synthèse de métabolites secondaires dont certains antibiotiques et certaines molécules anti-cancéreuses présence dans les eaux Ensemble des eubacteries pas Se-méthylation Ranjard et al., 2004

Conclusions: Plusieurs observations laissent entrevoir un rôle de la TPMT dans la méthylation de l’As Les formes méthylées de l’As sont obtenues dans les conditions d’expression de la TPMT ou chez des organismes TPMT+ 3. D’autres méthyle transférases pourraient jouer un rôle: UbiG, certaines methyle transférases putatives, …et MMT Même famille - plusieurs lignées (23) chez les g-protéobactéries structures différentes substrats différents?

Perspectives Voies de méthylation de l’As - Recrutement d’un étudiant M2 e. g. . les formes de bTPMT et la méthylation de substrats arséniés . Analyse comparative des affinités pour les substrats « S », « Se », « Te » et « As » * Recherche partenaire au sein du GDR-As (co-encadrement du M2) pour le volet chimie analytique (détection/caractérisation des formes méthylées)

Bactéries Pathogènes Opportunistes et Environnement Participants: L. Champier S. Favre-Bonté L. Ranjard C. Prigent-Combaret + qqes stagiaires C. Monnez E. Brothier S. Nazaret B. Cournoyer Remerciements: ToxNuc-Environnement CNRS – UCBL - ENVL Région Rhône-Alpes

Inorganic forms of arsenic are more toxic than organic forms ++ (?) ++ (?) Méthylation de l’A s MeAs DMeAs Excrété dans les urines + + ++ Methyl- arsonate Dimethyl- arsinate Trimethyl- arsine oxide (TMAO) arsenate AsH3, +++++ Inorganic forms of arsenic are more toxic than organic forms - Trivalent forms are more toxic than pentavalent arsenite Methyl- arsonite Dimethyl- arsinite Trimethyl- Arsine (TMA) +++ ++++ 0 (selon Cullen et Bentley, 2005) (According to Challenger (1951)) AsH3 gaz, As(-III) > As(III) > As (V) > composés méthylés