Les homogreffes valvulaires Prélèvement, conditionnement, traitement, conservation et utilisation J.P. BOURGEOT* ; O.HEQUET*, V. MIALOU*, R. HENAINE** *EFS Rhône Alpes site de Lyon **CHU de LYON Hôpital cardiologique Louis Pradel

Historique Les premières homogreffe de tissus humains sont implantées entre 1957 et 1962 En 1967, le Dr Ross réalisera la première autogreffe de valve en remplaçant la valve aortique défaillante du patient par sa propre valve pulmonaire. La valve pulmonaire étant quant à elle remplacée par une homogreffe. 50 ans après Cette technique influence toujours la chirurgie des homogreffes. Ces homogreffes étaient toujours « fraiches » c’est-à-dire conservées entre +4o et +8o C pendant une période pouvant aller jusqu’à 21 jours. Les résultats à longs terme n’étaient pas satisfaisant et les risques d’intervention itérative significativement augmentés. Pendant les années 70 la cryobiologie a connu un essor très important, les protocoles de congélation des tissus humains sont établis La congélation des homogreffes va permettre la constitution de stock, rendant plus aisé le choix et la gestion de la ressource

La qualité des homogreffes congelées est mise en évidence notamment grâce au travaux de MF O’Brien en Australie. A Paris G. Block parle de nouvelle homogreffe. En 1984, CRYOLIFE, banque de valves cardiaques cryoconservées est crée. Cette société collecte et distribue des valves cardiaques sur l’ensemble du continent nord américain puis rapidement à l’international. En 1988 la banque européenne d’homogreffes valvulaires, structure publique, voit le jour à Bruxelles, sa vocation est de collecter et distribuer des homogreffes sur le Benelux puis rapidement sur l'Europe. Pendant cette période, les laboratoires de cryobiologie français maitrisant déjà les techniques de congélation des cellules souches hématopiëtiques commencent, à la demande des chirurgiens, à collecter et distribuer des homogreffes. Les précurseurs sont l’hôpital St Louis de Paris et l’hôpital de la Timone en collaboration avec le centre de transfusion de Marseille.

En 1989 le congrès de la société française de cryobiologie se déroule à Marseille. Il est présidé par le docteur G. NOVAKOVITCH responsable de la banque de tissus. Il a fait date dans le développement des banques de valves en France.

Le programme est riche, les intervenants de premier plan Les échanges que nous avons alors, nous ont permis de nous structurer et d’établir des procédures communes basées en grande partie sur l’expérience de la banque de Bruxelles La banque d’homogreffe de Lyon nait en 1992 de la collaboration entre le CHU et le centre de transfusion sous l’impulsion du Pr Champsaur et de son assistant, le docteur Curtil. Plus de 20 ans après cette collaboration est toujours efficace grâce au Pr Ninet et au Pr Henaine

Prélèvement Les valves cardiaques sont issues soit Du cœur d’un donneur EME qui ne pourra pas faire l’objet d’une transplantation cardiaque Ces prélèvements sont validés par l’agence de la biomedecine et organisés par la coordination hospitalière Du cœur d’un receveur explanté lors de sa transplantation cardiaque Ces prélèvements sont de la responsabilité du chirurgien en charge de la transplantation En règle générale, ce sont les chirurgiens qui préparent et contrôlent au bloc opératoire les valves avant de les acheminer à la banque de tissus, leur expertise est à mon sens très importante. Dans tous les cas les greffons doivent être accompagnés De la fiche opérationnelle de prélèvement : sélection clinique du donneur ABM version 2008 De la fiche de préparation propre à chaque banque Du compte rendu des résultat du dépistages des maladies transmissibles ou des tubes de sang du donneur pour réaliser ces examens Du consentement du donneur s’il s’agit d’un cœur explanté Coordination, documentation et réglementation

Etape du procédé Réception Traitement Congélation Validation Prise en charge Enregistrement Traitement Décontamination antibiotique Congélation Cryopreservation & cryoprotecteur Congélation & Stockage Validation Contrôle règlementaire du dossier Distribution Traçabilité et biovigilance

Autorisation nécessaire Autorisation ANSM* Etablissement : BT/05/R/006 (5 ans) ANSM Procédé No PPT 211 Dossier LPPR** Valves Certification ISO 9001 : Mettre à disposition des Tissus *Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé **LPPR : liste des produits et prestations remboursables par l'Assurance Maladie. Référentiel Arrêté du 2 aout 2005 fixant la liste des tissus et des cellules pour lesquels le prélèvement sur une personne décédée présentant un arrêt cardiaque et respiratoire persistant est autorisé Arrêté du 27 octobre 2010 définissant les règles de bonnes pratiques relatives à la préparation, à la conservation, au transport, à la distribution et à la cession des tissus, des cellules et des préparation de thérapie cellulaire Arrêté du 14 mai 2010 fixant le contenu des informations permettant d’utiliser des éléments et produits du corps humain à des fins thérapeutique Arrêté du 22 juin 2011 relatif aux modalités d’exécution des analyses de biologie médicale pour la recherche des marqueurs infectieux sur les éléments et produits du corps humain prélevés à des fins thérapeutiques, à l’exception des gamètes, du sang et des produits labiles Arrêté du 4 novembre 2014 fixant les modalités de sélection clinique des donneurs d’organes, de tissus et de cellules

Réception L’acheminement à la banque de tissus doit être effectué le plus rapidement possible après la fin de la préparation chirurgicale. Les greffons sont réceptionnés et mis en traitement 7 jours/7. La réduction du délai entre le prélèvement et la congélation (48h en moyenne) augmente la qualité des greffons notamment en réduisant l’œdème A réception, les documents accompagnant le prélèvement sont contrôlés. Le donneur, le don et les tissus sont enregistrés sur le logiciel médico-technique unifié de l’EFS. Toutes les étapes du procédé seront enregistrées et tracées.

Face à face le centre de calcul et l’entrée des ZAC tissus et cellules

Environnement Premier sas d’accès au ZAC Nous travaillons en zone à atmosphère contrôlée (ZAC) L’air pulsé dans ces pièces est filtré, il y a une cascade de pression positive qui conduit l’air propre de la ZAC vers l’extérieur.. La tenue des techniciens limite au maximum le risque de contamination d’origine « humaine » Deux sas précédent la pièce confinée Premier sas d’accès au ZAC

Deuxième sas d’accès ZAC

Environnement L’ensemble des opérations de préparation ont lieu sous hotte à flux laminaire, l’air de la ZAC est donc filtrée une deuxième fois et est totalement dépourvu de particules vectrices de contamination

Traitement Les homogreffes sont rincées et incubée pendant 12 à 18 heures dans une solution de macromolécules additionnée d’antibiotiques. Un contrôle bactériologique est réalisé sur le liquide de transport, 30% sont contaminé essentiellement par des germes saprophytes de la peau. 83% de ces contaminations disparaissent après traitement. 96% des homogreffes sont donc stériles. Le mélange antibiotiques permet d’éliminer les contaminations faibles et surtout de «charger» le greffon d’antibiotiques contribuant ainsi à la résistance des valves à l’infection «in vivo»

SCOT 30 La solution de macromolécules colloïdales que nous utilisons a été spécialement développée pour le procédé de traitement et de congélation du Tissus cardio-vasculaire. Le polyéthylène Glycol de haut poids moléculaire permet «fixer» l’eau dans les cellules et de limiter la fuite d’eau extracellulaire et donc de réduire l’œdème. Cette solution à une AMM et est inscrite à la liste des PTA (produit thérapeutique annexe) autorisée pour le traitement et conservation des tissus par l’ANSM.

Préparation à la congélation : Cryopréservation Cette étape est nécessaire pour atténuer les effets délétères de la congélation Le plus important de ces effets est l’effet de solution ou effet de sel La congélation d’un liquide biologique isotonique n’est pas instantanée, la formation de cristaux de glace est progressive et entraine une augmentation de la concentration des composées salins de l'eau restante. Des concentrations salines élevées sont nuisibles en créant une fuite d'eau vers le milieu extracellulaire conduisant à la déshydratation de la cellule. De même lorsque le tissu présente un œdème trop important, l’eau extracellulaire se transforme en glace et trop de glace entre les cellules peut produire un effet d'écrasement, ce qui dans le cas d’un tissus peut entrainer des dommages structurels irréversibles.

Préparation à la congélation : Cryoprotecteur Les propriétés de ces molécules chimiques ont été découverte dans les années 1950 Les plus utilisés sont le glycérol et le DiMéthyl SulfOxide (DMSO) Elles ont entre autre propriétés d’abaisser le point de cristallisation de l’eau et de réduire l’effet de sel. Une solution de 10% DMSO est hyper osmotique, en plongeant progressivement avant congélation le tissus dans cette solution, on va gommer l’augmentation de la concentration saline dû à la congélation. Les fuites aqueuses seront minimum, la viabilité et les structures seront préservées. Les valves cardiaques sont conditionnées dans des poches en Téflon/Kapton résistantes aux basses température Elles sont en suspension dans une solution de SCOT à laquelle une solution de DMSO est progressivement rajoutée pour obtenir une concentration finale de 15% de DMSO Toutes les étapes décrites sont enregistrées sur un document et tous les DMU et PTA sont tracés

Congélation & stockage La congélation optimale des vaisseaux et valves cardiaques consiste en un refroidissement lent de 0,7 à 1o C /mn à partir du début de la cristallisation de l’eau Le refroidissement programmé est obtenu à l’aide d’un congélateur programmable composé d’une source de froid, l’azote liquide, reliée à une enceinte ventilée dans laquelle est disposé le tissus à congeler. Entre la source de froid et la cuve ventilée une électrovanne pilotée par un calculateur lui-même relié à une interface informatique Le calculateur gère l'ouverture de l’électrovanne en fonction du programme mis au point A la fin de la procédure de congélation, les poches sont stockées dans une cuve basse température. Ces cuves sont alimentées par l’azote liquide dont l’ébullition crée des vapeurs à -150oC

Congélation 0° -60o/ 73 mn 0,82o C/mn Liquide Solide Liquide Solide La courbe de congélation est divisée en 3 parties Avant le début de la cristallisation Le milieu est homogène et liquide Du début à la fin de la cristallisation Le milieu est hétérogène liquide et solide L’apport de frigorie est important A la fin de la cristallisation Le milieu redevient homogène et solide le refroidissement peut se poursuivre jusqu’à atteindre la température de stockage de -140oC / -150oC

Stockage Les cuves de stockage sont alimentées en permanence en azote liquide en fonction de la température et du niveau d’azote. Chaque cuve est reliée à un système de surveillance 7 jours/7, 24h/24

Validation L ’ensemble des documents réceptionnés et générés par le procédé sont conservés dans le dossier donneur et le dossier produit qui ne contient que des données anonymisées. Ces 2 deux dossiers sont contrôlés à différents niveaux par 3 responsables Responsable de la préparation Vérification de la qualité des prélèvements avant préparation ( délai, transport, contexte clinique… ) Vérification du déroulé de la préparation ( temps de d’incubation, courbe de congélation …) Responsable du contrôle qualité Vérification des contrôles qualités faits durant le procédé : Bactériologie, Sérologie Responsable d’activité Vérification de la sélection clinique du donneur et de l’ensemble du dossier Validation finale du tissu

Distribution Elle se fait sur prescription nominative établie par le chirurgien Le greffon peut être acheminé congelé au bloc opératoire, l’équipe de la banque ou du bloc opératoire assurant la décongélation extemporanément. Cette pratique est nécessaire quand l’indication ne peut être validée par l’examen macroscopique in situ Ou Le greffon peut être décongelé à la banque de tissus et transporté dans la solution SCOT jusqu’au bloc opératoire. Cette pratique est possible quand l’indication est certaine. La durée tolérée de transport peut aller jusqu’à 2 heures, ce qui nous permet de desservir l’ensemble de la région Rhône-Alpes. Le temps maximum d’utilisation d’une valve décongelée correspond au temps opératoire t

Utilisation

Stock

Conclusion Cette activité fait toujours partie de l’arsenal thérapeutique à disposition des chirurgiens. L’état actuel des stocks nous indique là ou est notre prochain défi : Maintenir un niveau de stock suffisant. Nous avons initié en Rhône Alpes Auvergne un projet de collaboratif visant à augmenter la collecte des homogreffes. Avec les coordinations de prélèvements, les équipes de chirurgie et la banque de tissus nous sommes en train de mettre en place une organisation nous permettant de : Récupérer toutes les valves des cœurs non utilisables pour la greffe y compris celles issues des prélèvements d’un donneur à cœur arrêté. Développer la collecte des valves prélevées sur le cœur explanté d’un patient greffé. Ce projet illustre parfaitement la maxime du Dr Alain Ehrsam fondateur de la banque de tissus de Lyon : « La chaine du froid ne serait se passer d’un seul des ces maillons, prélèvement, congélation, greffe chacun participe à son niveau à la réussite finale de l’intervention ».