Thermodynamique Équilibres conformationnels Liaison ligand-protéine Activation et activité constitutive Etc… Cours 2

Quelles sont les interactions qui stabilisent la liaison R - ligand? Et celles qui stabilisent la structure protéique? Cours 2

Rappel: Thermodynamique: Energie Libre R+D R.D Chemin réactionnel Cours 2

Relations entre ΔG, K et proportions… La différence d’énergie entre deux conformations de la protéine est de 2.6 Kcal/mol. Quelle est la proportion de protéine dans la conformation la plus stable? La moins stable? Un ligand reconnaît le récepteur avec une énergie de dissociation à l’équilibre de 13Kcal/mol. Quelle est sa constante d’affinité ? (unités ?) De dissociation à l’équilibre ? (unités ?) Quelle proportion du récepteur est occupée lorsque le ligand est à une concentration de 10-10M? De 10-6M? Quelles sont les constantes de vitesse d’association et de dissociation du ligand? Cours 2

Functional groups, drug-receptor interactions and drug design Peter Andrews School of Pharmaceutical Chemistry, Victorian College of Pharmacy, Ltd. 381 Royal Parade, Parkville, Victoria, 3052, Australia Trends in Pharmacological Sciences Volume 7 , 1986, Pages 148-151 Analysis of enzyme inhibition and receptor-binding data shows that the average strengths of ionic, hydrogen and van der Waals bonds in aqueous solution are of the order 10, 3 and 1 kcal mol−1 respectively. Peter Andrews illustrates the relevance of these numbers to drug design with back-of-the-envelope calculations on data from a selection of recent papers. Cours 2

Force des interactions dans l’eau? H+ Drug binding energy= ΣΔG°(pharmacophores) Cours 2

Pour chaque paire ligand – site de liaison: Cours 2

Résultats: GROUPE Energie (Kcal/mol) Kaff « fois » Rotation libre -0.7 1/3 Chargé NH+ 11.5 100 000 000 to 1 000 000 COO- 8.2 PO42- 10 Hetero-atomes OH 2.5 300 C=O 3.4 -O-, -N= or -S- 1.2 F, Cl, Br, I 1.3 Carbones (sp3)C 0.8 3 to 10 (sp2)C 0.7 Cours 2

Comment utiliser ce tableau? Il suffit d’additionner les différentes contributions à l’énergie de liaison, calculer l’affinité (ou le changement d’affinité) prévue, puis comparer avec les données expérimentales Cours 2

Et si on essayait… Neuroleptique O-CH3: 1/130 Phénylethanolamine Zn2+ Inhibiteur d’enkephalinase. Estérification: 1/400 Modification hydroxamate: 1/100 à 1/1000 Neuroleptique O-CH3: 1/130 Phénylethanolamine -OH meta, para: 1/3 – 1/30 Cours 2

Acetylcholinesterase Ki 47mM Anatoxine (nicotinique) KD 0.3µM Butanol Acetylcholinesterase Ki 47mM Anatoxine (nicotinique) KD 0.3µM Analogue ornithine Anticancéreux KD~5mM Dexetimide- Levitimide KD 0.1nM-300µM Cours 2

Woups! Là, je crois que j’exagère un peu… Glucagon KD 3nM Woups! Là, je crois que j’exagère un peu… Cours 2

Mutagenese dirigée du R β-adrénergique Quels sont les pharmacophores?  aa candidats pour le site de liaison? Cours 2

Asp = D, Asn = N, Ala = A wt D113N (TM3) D79A (TM2) Cours 2

Forces stabilisant la structure protéique Interactions hydrophobes Liens ioniques van der Waals Liens hydrogène < 1 Kcal >10 Kcal mais conservés à « longue distance » 1 à 3 Kcal  Structure rigide ou mobile? Cours 2

Structure protéique: rigide ou mobile? ConA, vue par diffraction RX Domaine Nterm CRF-R, vu en R.M.N. Cours 2

Voet - Figure 9-11d Folding funnels. (d) Rugged energy surface. Page 285 Cours 2

1 protéine, n conformations ≠ Energie libre Représentées par: Energie libre  Nbe de molécules  Cours 2

Voet - Figure 9-30 Mouvements de la myoglobine (simulation par dynamique moléculaire) (a) Ca et noyau hème. Page 305 Cours 2

Voet - Figure 9-30 (b) Une hélice a. Page 305 Cours 2

Représentation schématique des chemins réactionnels, équilibres… Conformation protéique: La réalité Représentée par: Energie libre Cours 2

Activation GPCRs: déplacement hélice 3  5 et 6. Cours 2

Pourquoi/comment? Cours 2

Lien ionique TM3: Wt (D113) D113E Cours 2

Liens H  Ser 204 et 207 ? Cours 2

Liens H catéchol (o- et p-OH) – Ser TM5 Cours 2

Lien H  Asn 293 ? Cours 2

Lien H β-OH – Asn TM6 Cours 2

Activité biologique? Comment définissez vous: (phrase ou schéma) Efficacité Puissance Agoniste Antagoniste Agoniste partiel Activité constitutive Cours 2

Activation spontanée? (canaux mécanosensibles) Cours 2

Activité constitutive : DRY (TM3/IC2) Cours 2

Activation constitutive du récepteur AT1A et hCTR-2 (a) Comparaison production IP après transfection par AT1AR et AT1A(L305Q); (b) Comparaison effet (cAMP  CREB  mRNA luciférase) après transfection par hCTR-2 : +/- calcitonine Cours 2

Activation spontanée récepteur??? Forme(s) actives? Repos Cours 2

Activité constitutive (1) Hypothèse: le récepteur occupé par l’agoniste change de conformation et est “activé”. KD J αJ αKD Cours 2

Définitions: Cours 2

Thermodynamique: Energie libre moyenne R* R HR HR* Cours 2

Prédictions Supposons que J = [R]/[R*] = 0.1 Quelle est la différence d’énergie entre R et R*? Quel sera l’effet biologique observé si on augmente la [R]tot? Cours 2

Conséquences: quelques questions très débattues pour l’instant L’activité constitutive est-elle exceptionnelle ou tout à fait générale? Implications thérapeutiques et pharmaceutique? “Induction” ou “sélection” de la conformation active par l’agoniste? Une ou plusieurs conformations actives? Cours 2

Activité constitutive? Hypothèse: [R*] / [R] = 1/ J = 0.01 [HR*] / [HR] = α / J = 100  α = 10 000 La conformation active est moins stable, de 1.3 x |log(0.01)| = 2.6 Kcal, que la conformation « au repos » La liaison de l’agoniste fournit 1.3 x log(10 000) Kcal/mol = 5.2 Kcal/mol au complexe pour permettre le changement de conformation. Cours 2

Agoniste partiel? Hypothèse: [R*] / [R] = 1/ J = 0.01 [H1 R*] / [H1 R] = α / J = 100  α = 10 000 [H2 R*] / [H2 R] = α / J = 1  α = 100 % de récepteurs activés lorsqu’ils sont occupés par l’agoniste 1? % de récepteurs activés lorsqu’ils sont occupés par l’agoniste 2? Quelle est la différence entre l’énergie fournie par les deux agonistes pour activer le récepteur? Comment représenteriez vous la courbe dose-effet de ces deux agonistes? Cours 2

Agoniste inverse Hypothèse: [R*] / [R] = 1/ J = 0.1 [H1 R*] / [H1 R] = α / J = 100  α1 = 10 000 [H2 R*] / [H2 R] = α / J = 0.01  α2 = ? Quel sera l’effet de H2? Représentez les courbes dose-effet attendues pour: 1/ J = 0.1, α1 = 10 000 et α2 = 0.0001 Cours 2

MC1/4 Souris wt: MSH stimule, agouti inhibe récepteurs mélanocortine. MC4 (peau)  mélanine  foncée MC1 (CNS)  satiété Souris surexprimant POMCMSH Tout à fait noires (et minces) Souris “agouti”: “Jaunes” (et obèses) Souris ko MC4: Tout à fait blanches Cours 2

“Induction ou sélection”? Question: est-ce que l’agoniste “sélectionne” les R* préexistants, ou bien est-ce que la liaison d’agoniste “induit” le changement de conformation de R  R*? Cours 2

Une ou plusieurs conformations actives? A discuter au cours prochain… Cours 2

Pathologie: Cours 2

L’histoire des récepteurs β-1 adrénergique S49G et R389G Décompensation cardiaque: Il y a quelques années: agonistes adrénergiques pour « restimuler » le muscle défaillant… mais mortalité augmentée! On est ensuite passé à des antagonistes adrénergiques, avec beaucoup plus de succès. Mutations β-1 adrénergique S49G et R389G : SNP (single nucleotide polymorphism): >1% population. Protègent contre mortalité élevée en cas de décompensation cardiaque Provoquent activité constitutive du récepteur β-1 adrénergique Bucindolol agoniste inverse sur R389G, protège contre mortalité; antagoniste neutre sur S49G et sans effet protecteur chez ces patients… Cours 2

Short-term desensitization of AC activity in membranes expressing the Ser-49 or Gly-49 variants of beta1AR Levin, M. C. et al. J. Biol. Chem. 2002;277:30429-30435 Cours 2

Intracellular cAMP in cells expressing the Ser-49 or Gly-49 variants of beta1AR and submitted to sustained activation by saturating concentrations of agonist Levin, M. C. et al. J. Biol. Chem. 2002;277:30429-30435 Cours 2

Fig. 3. Bucindolol effectively antagonizes the hyperfunctional beta1-Arg-389 receptor Liggett, Stephen B. et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 11288-11293 Cours 2 Copyright ©2006 by the National Academy of Sciences

Fig. 2. beta1AR genotype and drug-response correlations in nonfailing and failing human ventricles Liggett, Stephen B. et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 11288-11293 Cours 2 Copyright ©2006 by the National Academy of Sciences