Les propriétés cinétiques de l'aspartate transcarbamylase - jour 2 Carbamyl phosphate carbamylaspartate ATCase

BCM311 - rappel comportement embouts boite vide boîte moitié vide - retourner au buffet - remplir (gants) et mettre à l'endroit pour stérilisation ultérieure (ne pas remettre au buffet)

BCM311 - rappel comportement verrerie enlever toutes les étiquettes pipettes sales ménage remplir flacons laveurs vider poubelles de table nettoyer autour des balances désinfecter vos paillasses récupération de verre ≠ une poubelle vérification du contenu du tiroir

BCM311 - rappel comportement cahiers inscrire le tout directement TRÈS important cette semaine vu la quantité de résultats qui seront générés présence de: -titres des tableaux -unités -exemples de calculs (ex. dilutions) -détails des solutions que vous avez préparées

Jour 1 - courbe standard variabilité (attn au technique de pipetage!) n'oubliez pas de forcer la line par l'origine lors de la régression linéaire

Jour 1 - tests des dilutions de superbes résultats dilutions à utiliser: entre 1/1000 et 1/3000

Jour 1 - allostérie toutes les préparations suivent très bien le modèle sigmoïde allostérique

Dilution de l'enzyme - rappel Ex. : 3 ml d'une dilution 1/2000

ATCase est une enzyme allostérique ATCase - but ATCase est une enzyme allostérique 1ère semaine - préparation de l'enzyme - détermination de la dilution étudier les propriétés cinétiques de aspartate transcarbamylase (ATCase) d'E. coli vitesse

Organigramme - semaine 2 effecteurs d’ATCase (séries A, B et C) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de CTP (Série B) Dosage d’ATCase en présence d’ATP (Série C) Courbe standard de carbamyl aspartate

Organigramme - semaine 2 désensibilisation du site allostérique (A,D+E) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de Hg (Série D) Dosage d’ATCase en présence de Hg + CTP (Série E)

Organigramme - semaine 2 effecteurs d’ATCase (séries A, B et C) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de CTP (Série B) Dosage d’ATCase en présence d’ATP (Série C) Courbe standard de carbamyl aspartate

Biosynthèse des pyrimidines CTP est un inhibiteur d'ATCase ATP est un activateur d'ATCase assure une production égale de purines + pyrimidines

Vmax ne change pas Kprime change ATCase À noter: ►Kprime n'est pas la [S] à Vmax/2 ►ici à titre d'exemple seulement +CTP +ATP Vmax ne change pas Kprime change

ATCase enzyme allostérique: cinétique non-michaelienne

BCM311 - résultats typiques +CTP +ATP

Michaelis-Menten d'ATCase

Organigramme - semaine 2 désensibilisation du site allostérique (A,D+E) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de Hg (Série D) Dosage d’ATCase en présence de Hg + CTP (Série E)

Structure d'ATCase - séries A, D + E enzyme native, C6R6, 300 kDa

Structure d'ATCase - séries A, D + E sous-unité catalytique (C3) catalysent encore la réaction souvent plus active que l’holoenzyme cinétique michaelienne (courbe hyperbolique) pas sous la régulation de CTP ou d’ATP

Structure d'ATCase - séries A, D + E

Structure d'ATCase - effet de Hg ATCase+Hg plus active que native courbe hyperbolique ATCase ne répond plus à CTP

Structure d'ATCase - effet de Hg

Structure d'ATCase - effet de Hg ATCase+Hg plus active que native courbe hyperbolique ATCase ne répond plus à CTP

Points techniques préparer suffisamment d’enzyme diluée pour effectuer les séries en question (A-C ou A+D+E) diluer l’enzyme immédiatement avant son utilisation garder l’enzyme sur glace en tout temps sauf durant l’incubation

Lunettes et gants obligatoire Points techniques Lunettes et gants obligatoire préparer le réactif (attention: H2SO4) colorimétrique juste avant son utilisation (protège-le de la lumière) préparer seulement le volume du réactif requis: - A+B+C (~135 ml; 27 + 11 tubes = 114 ml) - A+D+E (~105 ml; 27 tubes = 81 ml) lire les DO rapidement après la terminaison des réactions: la couleur diminue avec le temps

Points techniques Réactions à 30oC (bains personnels) réactifs (tubes) préchauffés laissez des intervalles assez longs vérifiez la température des bains

préparation des solutions Points techniques préparation des solutions aspartate 125 mM (préparer 50 ml / table) carbamyl phosphate 36 mM (préparer 50 ml / table) solutions préparées semaine I acide perchlorique 2% tampon sodium phosphate 0,16 M pH 7,0

Points techniques Études cinétiques = précision chronométrage concentrations/dilutions/volumes homogène température

ATCase - questions ? Carbamyl phosphate carbamylaspartate aspartate

ATCase - graphique de Hill log (V/Vmax-V) vs log [aspartate] pente = nh besoin de Vmax Vmax historiquement déterminé à l’aide des graphiques "linéaires" de Lineweaver-Burk et d'Eadie-Hofstee

ATCase - graphique de Hill pour un enzyme allostérique, la courbe M+M est sigmoïde

ATCase - graphique de Hill alors, les graphiques linéaires (LB et EH) ne sont pas Comment déterminer Km et Vmax ?

Régression non-linéaire ("Curve fitting") logiciels puissants (Graphpad) utilise le formule MM pour les enzymes allostériques et détermine Vmax, Kprime et nH pour que la courbe tracée suit les données

Régression non-linéaire ("Curve fitting") native +CTP +ATP

GraphPad 6 - utilisation dans BCM311 présentation PowerPoint disponible sur le site internet du cours régression linéaire (courbe standard) régression non-linéaire (Michaelis-Menten) comparaison de modèles (ex. MM vs sigmoïde)

ATCase - résultats cibles/analyse Effecteurs allostériques Désensibilisation Michaelis-Menten Lineweaver-Burke Eadie-Hofstee Hill n = 2+ native: sigmoïde +Hg: michaelienne native: recourbée +Hg: linéaire native n = 2+ +Hg n = 1

Analyse des données - Excel préparez une « super » tableau avec toutes les données AVANT de faire les graphiques pour une série (ex. Série A) bien identifier les colonnes (unités etc.) copiez le tableau, changez les DO et tous les calculs se fait automatiquement pour la 2e série

Analyse des données - Excel

Analyse des données - Excel 1 µM = 1 µmole/L volume de réaction = 2 ml = 2 x 10-3 L Alors: µmole CA = µM x 2 x 10-3 L

Analyse des données - Excel = µmoles CA / (0,5 hr X 0,1 ml)

Analyse des données - Excel

Analyse des données - Excel Série A Série B

Cette semaine nouvelle courbe standard chaque équipe analyse ses propres résultats analyse des résultats (graphiques MM) avec GraphPad en fin de journée (fichier à Will) rapport à remettre dans 2 semaines