Les observations microscopiques en microbiologie. titre Notions Théoriques Associées 06 TP 07

1.1 1. Utilisation du microscope. 1.1. Description. Le support porte-lame Les oculaires Ils sont deux pour un meilleur confort. C’est lui qui monte et qui descend pendant la mise au point. 1.1 Les vis de mise au point Les objectifs Une macro et une micrométrique. Ils sont plusieurs organisés en barillet. Le diaphragme Très important pour la mise au point. Il règle le flux lumineux qui arrive à la lame. La lampe On peut faire varier son intensité lumineuse.

1.2 1. Utilisation du microscope. 1.2. La mise au point. Le principe de la mise au point est de rendre l’image nette. On joue sur deux éléments : C’est un peu technique. Prenons des exemples. 1.2 La distance focale La profondeur de champ Ce n’est pas la définition rigoureuse enseignée en optique, mais elle nous suffira pour aujourd’hui. La portion d’espace qui est nette à une distance focale donnée. La distance entre l’objet (la lame) et la lentille pour laquelle l’image est nette. Elle dépend de la distance focale: Plus l’objet est éloigné, plus la profondeur de champ est importante. On la fait varier en manipulant les vis macro et micrométriques qui éloignent ou approchent le support porte-lame. Elle dépend de l’ouverture du diaphragme: Plus il est ouvert, plus la profondeur de champ est faible

Il fait poser Blanche-neige. Comme elle est belle! En plus c’est une super actrice. En fait on s’en fout ! On est là pour la profondeur de champ. Je lui ferais bien un cours sur la profondeur de champs à Kristen Stewart. C’est un peu technique. Prenons des exemples. Un admirateur inconditionnel de Kristen Stewart veut prendre Blanche-neige en photo. Dans le cas de la microscopie, les distances sont toujours extrêmement faibles (< 1 mm). Il choisit le fond. Tout est net de 10 m à l’infini. Pour avoir la meilleure netteté possible, il faut jouer sur le deuxième facteur, le flux de lumière qui traverse la préparation. Il fait poser Blanche-neige. La profondeur de champ diminue avec la distance. Le fond devient flou. Tout est net de 1 m à 10 m. Elle dépend de la distance focale: Plus l’objet est éloigné, plus la profondeur de champ est importante. Le photographe monte directement dans la barque. Il s’approche encore. Le premier plan est flou. Tout est net de 0,8 m à 2 m.

1.2 1. Utilisation du microscope. 1.2. La mise au point. Le principe de la mise au point est de rendre l’image nette. On joue sur deux éléments : C’est un peu technique. Prenons des exemples. 1.2 La distance focale La profondeur de champ Ce n’est pas la définition rigoureuse enseignée en optique, mais elle nous suffira pour aujourd’hui. La portion d’espace qui est nette à une distance focale donnée. La distance entre l’objet (la lame) et la lentille pour laquelle l’image est nette. Elle dépend de la distance focale: Plus l’objet est éloigné, plus la profondeur de champ est importante. On la fait varier en manipulant les vis macro et micrométriques qui éloignent ou approchent le support porte-lame. Elle dépend du flux lumineux: Plus le flux est important, plus la profondeur de champ est faible

Reprenons les différents éléments. En pleine lumière, le diaphragme est fermé. Elle dépend de l’ouverture du diaphragme: Plus il est ouvert, plus la profondeur de champ est faible La profondeur de champ est maximale. Quand vient le soir, le diaphragme est ouvert. La profondeur de champ est minimale.

1.2 1. Utilisation du microscope. 1.2. La mise au point. Pour résumer, comment fait-on la mise au point ? On allume la lumière au maximum. Profondeur de champ maximale On ferme le diaphragme. On positionne l’objectif x40 contre la lame. 1.2 C’est le plus long, sa mise au point correspond à peu près à cette distance. On positionne l’objectif x10. Le barillet est conçu pour que la mise au point d’un objectif corresponde à la position de tous les autres. On observe. Si la luminosité est correcte, on finalise la mise au point. Si c’est trop sombre, on ouvre le diaphragme, tant pis !

Choisir le grossissement le mieux adapté. on ajoute sur la préparation 1. Utilisation du microscope. 1.3. Choix des objectifs. Choisir le grossissement le mieux adapté. Pour une vision globale numération des globules blancs numération des cultures cellulaires Objectif 10 1.3 Pour une vision précise État frais numération des globules rouges Objectif 40 Pour une vision approfondie Gram Ultra-structures des cellules végétales Dans ce cas, on ajoute sur la préparation de l’huile à immersion. Frottis sanguins Objectif 100

2.1 2. Les conditions d’aseptie. 2.1. Principe. Pour protéger le manipulateur Les manipulations se déroulent dans des conditions stériles. Pour protéger la préparation Empêcher la contamination des souches étudiées. Le contact direct avec un produit contaminé. Il existe deux sources principales de contamination. Les aérosols. Contamination inodore, indolore et sans saveur Ebullition d’un liquide Stérilisation de l’oese au bec. Ouverture d’un tube avec flambage.

2.2 2. Les conditions d’aseptie. 2.2. La paillasse. La manipulation s’organise autour du bec (électrique ou bunsen). La chaleur dégagée provoque un courant d’air chaud qui s’élève au-dessus de la source de chaleur et entraîne les microorganismes en suspension dans l’air. Poser le matériel stérile (boîte ouverte, pipettes, etc.) à proximité de la source de chaleur. Ne pas gêner le mouvement d’air par des mouvements intempestifs. On reste assis à la paillasse durant toute la durée de la manipulation. On ne passe pas les mains (non stériles) au-dessus du matériel.

2.2 2. Les conditions d’aseptie. 2.2. La stérilité du matériel. Contaminant: microorganisme indésirable. 2.2. La stérilité du matériel. 2.2 On dispose de deux catégories de matériel. Le matériel stérile - Intérieur des boîtes de Pétri - Pipettes en plastique sous blister stérile Il doit être conservé stérile pendant la manipulation. non stérile Le matériel non stérile - Extérieur des boîtes de Pétri Pipettes Pasteur Oese Oese flambée Il doit être stérilisé avant la manipulation (si besoin est). Il est chauffé au bec. Pipettes Pasteur passée à la flamme. Après la manipulation, tout le matériel utilisé est décontaminé. Passage au bec Trempé dans l’eau de Javel Cols des tubes flambés

3.1 3. Les types de préparation. 3.1. Etat frais. Sans coloration l’observation est moins facile. A cause de leur faible épaisseur, les cellules paraissent transparentes. Le principe d’un état frais est l’observation d’une cellule vivante. On peut mettre en évidence leur mobilité. Il y a une astuce ! Une cellule qui bouge n’est pas nécessairement mobile. Elle peut suivre passivement un courant du à une légère déclivité de la paillasse. Cellules immobiles. Une cellule mobile

3.1 3. Les types de préparation. 3.1. Etat frais. Méthode On dépose une goutte de suspension sur une lame. Si la souche provient d’une gélose: Préparer une suspension en prélevant une oese de colonie et mélanger dans quelques gouttes d’eau (non stérile). On dépose une lamelle On observe au microscope à l’objectif x 40 Il ne faut pas trop tarder car la préparation à tendance à sécher

3.2 3. Les types de préparation. 3.2. Coloration au bleu de méthylène. La coloration permet de mieux visualiser les formes des cellules. Les bains de colorant nécessite que la préparation soit fixée au préalable. Les cellules sont donc mortes. On étale une goutte de suspension sur une lame. On passe la lame dans la flamme « éclairante » On trempe la lame dans le bleu de méthylène. On observe au microscope à l’objectif x 100

3.3 3. Les types de préparation. 3.3. Coloration de gram. La coloration de gram est la première étape de classification des bactéries. 3.3. Coloration de gram. 3.3 Elle permet de déterminer la structure de la paroi. (voir le cours) Fixation de la suspension sur une lame. Violet de gentiane + lugol -----> formation d’un cristal violet dans le cytoplasme Alcool -----> dissolution du cristal si la paroi est épaisse (imperméable à alcool), il n’y a pas de décoloration. - si la paroi est fine, il y a décoloration. Fuchsine ou safranine -----> la coloration rose est visible si la cellule est décolorée Gram + Gram -