CHMI 4206 Bioinformatique appliquée Prof: Eric R. Gauthier, Ph.D. Département de chimie et biochimie Université Laurentienne Protéomique 1- Approches expérimentales de base CHMI 4206F - Automne 2010

Protéomique La protéomique est une science relativement nouvelle qui a pour but l’étude de la fonction des protéines. CHMI 4206F - Automne 2010

Protéomique En particulier, la protéomique visera à élucider: La structure des protéines Le profil d’expression de protéines dans un tissu/organe particulier La localisation intracellulaire de la protéine d’intérêt Le profil d’interaction de protéines avec d’autres molécules (ligands, substrats, protéines, ADN, etc). CHMI 4206F - Automne 2010

Protéomique On retrouve deux approches principales de la protéomique: Approche « une protéine à la fois» Ici, on purifie, séquence et caractérise une protéine d’intérêt Utile par exemple dans le design d’une molécule qui inhibera/activera une protéine d’intérêt Approche globale: Ici, on recherche initialement à caractériser l’ensemble des protéines exprimés dans des conditions particulières; Peut servir, par exemple, pour 1) trouver des marqueurs protéiques (e.g. indicatrices de maladies); 2) identifier des protéines impliqués dans un phénomène biologique particulier; 3) élaborer un réseau d’interaction protéine-protéine impliqué dans un phénomène d’intérêt. CHMI 4206F - Automne 2010

Protéomique CHMI 4206F - Automne 2010

Niveaux de structure des protéines La séquence en acides aminés (structure primaire) permet d’obtenir des informations importantes: Motifs de séquence indiquant la fonction de la protéine (e.g. site actif, interaction avec d’autres protéines) Présence de sites cibles pour des modifications post-traductionnelles (e.g. phosphorylation) Modélisation: détermination de la structure secondaire/tertiaire La structure secondaire/tertiaire permet d’obtenir des informations sur: La présence de motifs de repliement particuliers L’interaction entre la protéine et son substrat/autres biomolécules Le design d’inhibiteurs de la protéine d’intérêt CHMI 4206F - Automne 2010

Outils bioinformatiques CHMI 4206F - Automne 2010

Protéomique La caractérisation des protéines requiert initialement: La purification des protéines Permet aussi de générer des outils d’analyse importants (p.ex. anticorps). La détermination de la séquence en acides aminés et l’analyse bioinformatique de ces séquences La détermination de modifications post-traductionnelles CHMI 4206F - Automne 2010

Caractérisation de protéines 1. Approches classiques Méthodes en milieu liquide (LC) basée sur la séparation de protéines en fonction de leur propriétés physico-chimiques: Chromatographie d’exclusion: Séparation en fonction de la taille Chromatographie d’échange d’ions: Séparation en fonction de la charge Chromatographie d’affinité: Séparation en fonction de la liaison d’un ligand/anticorps CHMI 4206F - Automne 2010

Caractérisation de protéines 1. Approches classiques Chromatographie à d’exclusion: Séparation selon la taille Les petites protéines peuvent pénètrer dans les pores de la matrice de séparation, ralentissant leur élution; Les grosse protéines, qui ne peuvent pas pénétrer dans les pores de la matrice, éluent plus rapidement que les petites protéines; CHMI 4206F - Automne 2010

Caractérisation de protéines 1. Approches classiques Chromatographie à échange d’ions: Basée sur la différence de charge entre protéines; La matrice (chargée positivement ou négativement) retiendra les protéines de charge opposée, qui seront éluées suite à l’application d’un gradient de sel/pH. Desorption Adsorption Anion exchanger NaCl CHMI 4206F - Automne 2010

Caractérisation de protéines 1. Approches classiques Chromatographie d’affinité: Basée sur l’interaction réversible entre une protéine et une autre molécule (ligand); Le ligand peut prendre plusieurs formes: Ion (Nickel) Petite molécule (p.ex. glutathion [Glu-Cys-Gly]) Protéine (p.ex: protéine A [lie anticorps]) Anticorps Approche limitée pas la disponibilité d’un ligand. Ligand Protéines contaminantes Protéine d’intérêt CHMI 4206F - Automne 2010

Caractérisation des protéines PAGE-SDS Séparation des protéines en fonction de leur masse CHMI 4206F - Automne 2010

Caractérisation des protéines Spectrométrie de masse Permet de déterminer la masse des ions de la molécule d’intérêt; Comprend trois composantes principales: L’ionisation de la molécule d’intérêt. Deux méthodes principales pour les protéines: Electrospray ionization; Matrix-assisted Laser Desorption/Ionisation La séparation des ions selon le rapport masse/charge (m/z) Time of flight: les ions sont séparés selon le temps qu’ils prennent à voyager dans un vacuum avant d’atteindre le détecteur Un détecteur pouvant déterminer le nombre d’ions avec un rapport m/z donné. CHMI 4206F - Automne 2010

Caractérisation des protéines Spectrométrie de masse CHMI 4206F - Automne 2010

Caractérisation des protéines Spectrométrie de masse 1. Identification de la protéine par la taille des fragments générés par MS: Problèmes potentiels: modifications post-traductionnelles modifiant le rapport m/z. Absence des fragments de la masse observée dans les bases de données CHMI 4206F - Automne 2010

Caractérisation des protéines Spectrométrie de masse 2. Séquençage par MS/MS en tandem Ici, la protéine est soumise à deux étapes consécutives de MS: Premier MS: fragmentation de la protéine en petits morceaux; Deuxième MS: fragmentation de fragments sélectionnés du premier MS en fragments encore plus petits. En comparant la taille des fragments obtenus lors du deuxième MS, on peut déterminer la séquence en acides aminés du fragment. CHMI 4206F - Automne 2010

Caractérisation des protéines Exemple: co-immunoprecipitation Dans le milieu cellulaire, les protéine n’existent pas de manière isolée; Les protéines sont plutôt impliquées dans les interactions complexes avec plusieurs autres protéines; Ces interactions sont essentielles pour plusieurs raisons: Formation d’un protéine multimérique fonctionnelle Localisation intracellulaire; Régulation de la fonction protéique Un moyen d’identifier ces complexes protéiques est la co-immunoprecipitation CHMI 4206F - Automne 2010

Caractérisation des protéines Exemple: co-immunoprecipitation Ho et al. Nature. 2002 Jan 10;415(6868):180-3 CHMI 4206F - Automne 2010

Caractérisation des protéines Exemple: co-immunoprecipitation CHMI 4206F - Automne 2010

Caractérisation des protéines Exemple: co-immunoprecipitation CHMI 4206F - Automne 2010

Caractérisation de protéines 2. Approches globales Utilisent deux techniques très puissantes: L’électrophorèse à deux dimensions La spectrométrie de masse Généralement, on se soucie peu de la pureté de la protéine, et on va davantage insister sur la quantité d’information qu’on peut obtenir (p.ex. profil d’expression de protéines dans un tissu donné vs tissu malade). Une des approches principales de la recherche de marqueurs protéiques. LC CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales Électrophorèse en 2 dimensions (2DGE) Se fait en deux étapes: 1) Séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique (pI) par focalisation isoélectrique; 2) Séparation en fonction de la masse par PAGE-SDS; Le résultat est un gel où des taches représentent des protéines séparées selon leur charge et leur masse. CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales Électrophorèse en 2 dimensions (2DGE) Point isoélectrique Masse moléculaire CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales Électrophorèse en 2 dimensions (2DGE) Le 2DGE donne une résolution de beaucoup supérieure au PAGE-SDS conventionnel: P. ex: des protéines de même masse mais de pI différent seront séparées. Différents degrés de résolution sont possible: différentes taille de strips et de gammes de pH (lors de la focalisation isoélectrique) Différentes concentration de gel d’acrylamide (lors du PAGE-SDS); On peut alors se servir de ces résultats de plusieurs façon: Identifier les protéines séparées grâce à leur pI/masse Découper les taches d’intérêt et les soumettre à une analyse MS/MS pour séquençage. CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales Électrophorèse en 2 dimensions (2DGE) CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales Électrophorèse en 2 dimensions (2DGE) Swiss-2DPAGE contient une base de données annotée représentant l’analyse par 2DGE de nombreux tissus/cellules sont disponibles: http://au.expasy.org/ch2d/ CHMI 4206F - Automne 2010

Analyse 2DGE de plasma humain CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales Combinaison 2DGE/MS Trypsin + Gel punch p53 MS CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales Limites du 2DGE Les protéines trop grandes ne sont pas bien séparées dans la deuxième dimension; Les protéines trop petites sont éluées du gel Les protéines très acides et très basiques ne sont pas bien séparées lors de la focalisation isoélectrique Les protéines membranaides ont tendance à s’aggréger et précipiter Le protéines abondantes dominent la détection et empêche de détecter des protéines d’abondance mineure. CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales MUDPIT MUDPIT: MultiDimensional Protein Identification Technology Basée sur la séparation en deux dimensions par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), suivie d’identification par MS. 2D-HPLC: la séparation se fait selon deux principes de séparation utilisés consécutivement: Chromatographie à échange d’ion (IEX): Séparation selon la charge; Chromatographie en phase inverse (RP): Séparation selon le degré d’hydrophobicité: les molécules les plus hydrophobe éluent en premier CHMI 4206F - Automne 2010

HPLC CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales MUDPIT Trypsin + proteins p53 IEX-HPLC RP-HPLC CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales Méthodes d’analyse différentielle Basées sur des variations des méthodes usuelles permettant de détecter rapidement des différences entre deux échantillions des protéines; 2 méthodes puissantes: DIGE – Differential 2DGE ICAT – Isotope Coded Affinity Tag CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales DIGE Implique: Le marquage de deux échantillons, chacun avec une sonde fluorescente différente: Cy3: fluoresce rouge Cy5: fluoresce bleu Le mélange des échantillons et leur électrophorèse 2DGE L’analyse de l’intensité de la fluorescence verte/rouge de chacun des spots: Si rouge plus intense: expression plus élevée dans l’échantillon marqué par Cy3 Si vert plus intense: expression plus élevé dans l’échantillon marqué par Cy5. Les spots intéressants sont alors découpés et analysés par MS. Un mélange des deux échantillons suivi de son marquage au Cy2 (fluorescence jaune) est utilisé comme standard interne. Comme les deux échantillons sont séparés sur le même gel 2D, on élimine du coup toute variation inhérente à l’électrophorèse et on peut facilement comparer les 2 échantillons. CHMI 4206F - Automne 2010

DIGE CHMI 4206F - Automne 2010

DIGE – marquage avec Cy2/3/5 CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales DIGE Cy3 Cy5 Cy2 Cy5+Cy3 CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales DIGE CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales ICAT Basée sur le marquage différentiel de 2 échantillons, un avec un marqueur léger (contenant l’hydrogène), l’autre avec un marqueur lourd (contenant le deutérium); Les échantillons sont ensuite mélangés et analysés par MS: Comme les échantillons sont marqués avec des marqueurs de masse légèrement différente, ils pourront être distingués sur le spectre MS L’intensité des pics MS servira pour identifier les protéines exprimés différemment dans les 2 échantillons. CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales ICAT CHMI 4206F - Automne 2010

2. Approches globales ICAT CHMI 4206F - Automne 2010