Cancérologie fondamentale Apport de la Biologie Moléculaire B. Gubler

Cancérologie fondamentale - Apport de la Biologie Moléculaire I- Les plateformes hospitalières de génétique moléculaire 1- INCa 2- Organisation et structure 3- Activités II- La Biologie Moléculaire: un outil 1- Définition 2- Place dans la prise en charge des patients 3- Accessibilité de la cible 4- Les différents types d’analyses III- Les analyses d’Oncobiologie Moléculaire: dans quel contexte 1- les marqueurs participant au diagnostic 2- les marqueurs pronostiques orientant la stratégie de traitement du patient 3- les marqueurs déterminant l’accès à une thérapie ciblée 4- les marqueurs permettant le suivi de la maladie résiduelle.

Plateformes hospitalières de génétique moléculaire des cancers Les plateformes hospitalières de génétique moléculaire des cancers (1) La Biologie moléculaire: une nécessité Ce n’est pas (plus) un luxe dans la prise en charge des patient atteints de cancer INCa: Institut National du Cancer - Agence sanitaire et scientifique de l’état. - Développe l’expertise et finance des projets dans le domaine des cancers Mesure 21 du plan Cancer 2009-2013: Garantir un accès égal aux traitements et aux innovations. - Action 21.2: Développer les plateformes de génétique moléculaire des cancers et l’accès aux tests moléculaires. Plateformes hospitalières de génétique moléculaire des cancers Plateformes hospitalières de génétique moléculaire Regroupent: - Service d’Anatomopathologie - Service de cytogénétique - Laboratoire(s) d’Oncobiologie Moléculaire - Peuvent appartenir au même établissement ou à des établissements différents. - Depuis 2006, 28 plateformes soutenues par l’INCa et la DGOS.

Les plateformes hospitalières de génétique moléculaire des cancers (2) Vocation: - Réalisation des tests moléculaires innovants pour l’ensemble des patients de la région, quel que soit l’établissement où ils sont pris en charge, CHU, CLCC, CH ou établissements privés. - Organisation d’un maillage territorial suffisant pour que les prélèvements tumoraux parvenant dans les laboratoires habituels d’anatomopathologie ou d’hématocytologie puissent être pris en charge rapidement dans une plateforme avec laquelle il existe des liens organisés. Activité des plateformes Activités regroupées en fonction de l’utilisation des marqueurs dans la prise en charge des patients: 1- les marqueurs prédictifs déterminant l’accès à une thérapie ciblée; 2- les marqueurs orientant le processus diagnostique; 3- les marqueurs participant au diagnostic, en complémentarité de paramètres cliniques, morphologiques, biologiques ; 4- les marqueurs pronostiques orientant la stratégie de traitement du patient; 5- les marqueurs permettant le suivi de la maladie résiduelle.

La Biologie Moléculaire Définition: La biologie moléculaire: Discipline consacrée à l’étude des molécules porteuses du message héréditaire (ADN, ARN) de leur structure, de leur synthèse et de leur altération. La biologie moléculaire désigne également l’ensemble des techniques de manipulation d’acides nucléiques, aussi appelées techniques de génie génétique La biologie moléculaire = outil Acides nucléïques ADN ARN Associée à différente technologie - PCR - Electrophorèse - Analyse de fragment - Digestion enzymatique - Séquençage - Snapshot - Micropuces (trascriptome, CGH-, miR-array)

Place de la Biologie Moléculaire (1) Clinicien Chirurgien Tissue  Cellule Anatomopathologiste Noyau  chromosomes Cytogénéticien Biologiste moléculaire ADN ARN Organe

Place de la Biologie Moléculaire (2) Organe Clinicien Chirurgien Médecin patient - Examen - Investigations Tissue  Cellule Anatomopathologiste Noyau  chromosomes Cytogénéticien Biologiste moléculaire ADN/ARN Excérèse, biopsie, µ-biopsie, ponction Identification Nature - Classification Origine tissulaire Immunohistochimie Expression de marqueur - Détection et caractérisation de translocations chromosomiques (BCR/ABL, M, m, µ) - Détection d’anomalies infra-chromosomique Mutation de gène. Suivi et quantification de la MRD. Caryotype: - Anomalies de nombre - Anomalies de structure FISH - Délétion / Duplication - Translocation

Accessibilité de la cible Le génome Humain - 46 chromosome (44+XX ou 44+XY) - 30 000 gènes - 3,2x 109 paire de base (6,4x109/cellule diploïde) Amplifier la cible (gène d’intérêt) pour pouvoir l’individualiser et l’analyser PCR (réaction de polymérisation en chaine) - toute analyse de BM débute par un étape d’amplification 2n copies de la région cible n cycles Limites et Echecs - Quantité de matériel (µ-biopsie) - % de cellules tumorales - Hétérogénéité des cellules tumorales

Objectif des analyses de Biologie Moléculaire en cancérologie La BM identifie 1- les marqueurs diagnostiques et ou pronostiques orientant la stratégie de traitement du patient 2- les marqueurs participant au diagnostic 3- les marqueurs déterminant l’accès à une thérapie ciblée 4- les marqueurs permettant le suivi de la maladie résiduelle. Les marqueurs diagnostiques et ou pronostiques orientant la stratégie de traitement du patient

Marqueurs orientant la stratégie de traitement du patient L’identification d’altérations génétiques au sein des cellules cancéreuses a permis la mise en évidence de nouveaux biomarqueurs moléculaires. Ces paramètres sont aujourd’hui indispensables pour le diagnostic, la classification, le choix et la surveillance du traitement La mise en évidence de ces altérations a permis d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, puis de développer des thérapies ciblées contre celles-ci. La LMC est une néoplasie myéloproliférative caractérisée par la présence du chromosome Philadelphie (ch22) t(9 22)(q34;q11) à l’origine d’un transcrit de fusion (ARNm BCR-ABL) La protéine codée par ce transcrit a une activité tyrosine kinase constitutivement dérégulée directement responsable de la transformation leucémique. La protéine est la cible d’un inhibiteur de tyrosine kinase (ITK), l’imatinib (inhibiteur compétitif de l’ATP), dont l’efficacité thérapeutique importante a profondément transformé la prise en charge thérapeutique et le pronostic de cette hémopathie. 88 % des patients sont désormais en vie 6 ans Exemple princeps: Imatinib et traitement des leucémie myéloïde chronique (LMC).

+ Caryotype et marquage FISH: Exemple de t(9;22)(q34;q11) 1) Isolement des cellules du patient 2) Culture à court terme 3) Blocage des division en prométhaphase ou métaphase par addition de colchicine 4) Choc hypo-osmotique: éclatement des cellules + Addition de sondes spécifiques de gènes pour la recherche de translocations particulières FISH (sonde ABL + sonde BCR) Colocalisation translocation t (9;22)(q34;q11) Caryotype : t(9;22)(q34;q11) : - >90% des LAM et pronostic très sombre dans les LAL Touche 30% des LAL de l’adultes surtout après 50 ans, plus rare dans les LAL de l’enfant (5%), - Conséquences moléculaires : traduction d’une protéine Chromosome Philadelphie sur caryotype

t(9;22)(q34;q11) Gène BCR (22q11.2) Fonction: - localisation cytoplasmique - Ser/thr kinase avec domaine d’oligomérisation - activation cellulaire passant par la voie RAS/MAP m-bcr T(9;22)  P190 M-bcr T(9;22)  P210 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Gène ABL1 (9q34.1) Fonction localisation nucléaire et cytoplasmique 1- Nucléaire: rôle dans la régulation l’apoptose après dommages de l’ADN (les mécanismes ne sont pas élucidés) 2- Cytoplasmique: Fonction dans l’adhésion cellulaire 1a 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1b Tyrosine kinase Premier Intron 200Kb T(9;22)  P210 T(9;22)  P190 Guasch G., Translocations chromosomiques et cancer. http://imgt.cines.fr, Montpellier, France, 2002. DO Ex1 Ex12 BCR/ABL: 190 (LAL) or 210 kDa (LAM) localisation cytoplasmique. Ex2 Oligomérisation de la protéine de fusion (via le domaine BCR) activité kinase d’ABL 1- Induction de la prolifération cellulaire par activation de la voie de signalisation (Ras/MAPK) 2- Inhibition de l’ apoptose ( la production de bcl-2) 3- Anomalies d’adhésion cellulaire: perte d’adhérence aux cellules stromales de la moelle responsable d’une prolifération anarchique des progéniteurs leucémiques

qRT-PCR avec sonde Taqman PRINCIPE - Isolement des cellules nucléées (sang, moelle, LCR …) Extraction de des ARN Reverse transcription Réalisation de PCR quantitative avec sonde taqman R Q Sonde Taqman ABL Primer spécifique BCR Primer ABL 1) Activité Polymérase R Q R 1) Activité Exonucléase Q

Sensibilité des techniques de Biologie moléculaire pour le suivi de la MRD

2- les marqueurs participant au diagnostic

Marqueurs participant au diagnostic Exemple du diagnostic de clonalité lymphoïde Lymphocytes B Ig membranaire (BcR) Anticorps Ig solubles Plasmocytes Activation Maturation Prolifération Isotype kappa Isotype lambda IgH IgL Sous types et loci Isotype M, D, G, A, E Cytologiste ou pathologiste - Morphologie - Isotype - Marqueurs membranaires ou intracellulaires 3 loci: réarrangements IGH, IGK et IGL Biologiste moléculaire 4 loci: réarrangements TCRA, TCRB, TCRG et TCRD Lymphocytes T TcR Sous populations corécepteur - T CD8+ - T CD4+ TCRab TCRgd Sous types et loci

Clonalité lymphoïde à l’échelle de l’organisme 1) Polyclonal 109 à 1012 lymphocytes différents qui se distinguent par l’Ig ou le TCR qu’ils synthétisent 2) Oligoclonalité Lymphocytose réactionnelle - Infection - Chronicité 3) Monoclonalité au sein d’une population Polyclonale A surveiller 3) Monoclonalité

Identification des réarrangements des gènes du TCRg par PCR PRINCIPE - Isolement des cellules nucléées (sang, moelle, LCR …) Extraction de l’ADN Réalisation de PCR multiplex ciblant les locus des Igs et TCR 1 2 3 4 5P 6 7 8 A 9 10 B 11 5 JP1 JP J1 JP2 J2 C1 C2 3’ 5’ V 120kb 2 J1 RSS TRGV2 Germinal Forward Primer TCRGV Reverse Primer JG J1 Recombiné Forward Primer TCRGV Reverse Primer JG No amplification Amplification Produit de PCR

L’amplification et l’analyse des produits de PCR dépend de plusieurs paramètres 1 2 3 4 5P 6 7 8 A 9 10 B 11 5 JP1 JP J1 JP2 J2 C1 C2 3’ 5’ V 1) Multiplicité des gènes V et J PCR Multiplex : Forward Primer: Consensus TCRGV Reverse Primer: Consensus TCRG JG + Consensus TCRG JP 2) Multiplicité des combinaisons possibles V1J1; V1J2; V1JP; V1JP1; V1JP2, V2J1; V2J2 …… Ect…. 3) Diversité jonctionnelle Délétion des nucléotides en 3’ des gènes V V deletion 0 -1 -2 -3 ect Délétion des nucléotides en 5’ des gènes J J deletion 0 Coupure aléatoire Insertion nucleotides Insertion 0 +1 +2 +3 ect Addition aléatoire de nucléotides (TdT) Variation de la taille des produits de PCR = 15pb  Analyse en agarose non apropriée  Analyse sur Genetic Analyzer (séquenceur) et Sizing  PAGE

Etude des réarrangementd des gènes des Immunoglobulines et du TCR Analyse des produits de PCR par électrophorèse capillaire sur séquenceur Cellules Produits de PCR Genscan 160 170 180 190 200 210 220 230 240 100 300 400 500 600 700 800 Tissu polyclonal L 1 2 3 Expansion Monoclonale dans Tissu polyclona 600 1200 1800 2400 3000 3600 4200 4800 980 1920 2880 3840 4800 5760 6720 7680 Expansion monoclonale

Marqueurs participant au diagnostic – ex du diagnostic de clonalité lymphoïde Cellules Produits de PCR Tissu polyclonal Expansion oligoclonale Recours à l’étude des réarrangement des gènes des Ig et du TCR lorsque - Immunohistochimie ou cytométrie de flux insuffisamment informative Exemples - Lymphocytose monoclonale / Lymphocytose réactionnelle - Lymphome T riche en B

Quantification de la maladie résiduelle par RQ-PCR Suivi du traitement: Quantifiation de la MRD 1) courbe étalon Diagnostic Blastes = 85 to 99% 10-1 10-2 1/10è 10-3 1/10è 10-4 1/10è 10-5 1/10è Mix (3 à 5) ADN polyclonal Echantillon du patient Jour = X % de blastes = ? 2) Quantification 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 Log Ct Quantity X

les marqueurs déterminant l’accès à une thérapie ciblée

Thérapeutiques ciblées (1): Caractéristiques des cellules tumorales Contrôle génétique de la division cellulaire La division cellulaire est régulée, positivement et négativement, par l’expression de nombreux gènes. Tout gène pouvant devenir transformant par mutation ou par surexpression est un oncogène Le CANCER est dû à des ALTERATIONS GENETIQUES qui perturbent l’équilibre entre stimulation et inhibition de la prolifération cellulaire Ces mutations se traduisent par: • Indépendance vis-à-vis des signaux de prolifération • Perte de contrôle du cycle cellulaire • Perte des capacités de mort cellulaire programmée (apoptose) • Acquisition du phénotype d’immortalité des lignées cellulaires • Développement de capacités d’invasion et de métastase • Mise en place d’une angiogénèse spécifique à la tumeur

Thérapeutiques ciblées (2): Mécanismes impliqués dans l’oncogenèse = Cibles thérapeutiques Spécifiques des cellules tumorales => meilleure tolérance => nouveaux modes d’action : – Bloquer la néoangiogenèse – Bloquer la prolifération – Bloquer la dissémination – Action cytotoxique additionnelle pour certaines thérapeutiques ciblées (rituximab, trastuzumab) Cascade de signalisation Activation de Gènes Angiogenèse Protection vis-à vis de signaux pro-apoptotiques Prolifération cellulaire - Perte de contrôle du cycle cellulaire - Indépendance vis-à-vis des facteurs de croissance M S G1 G2 Perte d’adhérence cellulaire Migration Capacité d’invasion Métastase Dédifférenciation immortalisation Les voies de la signalisation comme cible pour le développement de nouvelles molécules anticancéreuses

Les récepteurs de la famille HER (HER=Human EGF Receptor) D’après Shepard HM, Brdlik CM, Schreiber H.J Clin Invest. 2008 Nov;118(11):3574-81. Review. HER2 TK EPG NRG1 NRG2 HER3 HER4 HB-EGF EPR BTC AR NRG3 NRG4 EGF TGF-a EGFR La fixation d’un ligand induit l’oligomérisation don’t le résultat est la stimulation de l’activité tyrosine kinase qui conduit à l’activation des voies de signalisation en aval, en particulier les voies RAS/MAP-K et PI3K/Akt. AR, amphireguline; BTC, betacelluline; EPG, epigen; EPR, epireguline; HB-EGF, heparin-binding EGF. Famille de récepteur ubiquitaire 4 membres (plus variants par épissage alternatif): EGFR (ou HER1), HER2, HER3, et HER4. EGFR, HER2, et HER4 ont un domaine tyrosine kinase (TK) activé par oligomerization. - 11 types de ligands (certains également générés par épissage alternatif (ex: les neuregulines [NRGs]) EGFR HER1 ErbB1 HER2 HER2/neu ErbB2 HER3 ErbB3 HER4 ErbB4 Domaine De fixation du ligand Domaine TM Domaine Tyrosine kinase TK TK TK

Les Voies de signalisation des récepteurs de la famille HER EGFR, HER2, HER3, HER4 Ligand P P Ras Raf Mek1/2 Erk1/2 MAPK Prolifération PI3K AKT mTOR Progression du cycle cellulaire Apoptose Bad PTEN PKC F. Transcription c-myc c-fos c-jun STATs Transcription de gènes AP1 Voie RAS/MAPK Voie STAT Voie PI3/AKT

Conséquences des perturbations des voies de transduction du signal par les récepteur HER Origine des perturbations 1) Les récepteurs Hyper-expression des récepteurs Mutations des récepteur entrainant Indépendance vs ligand Auto-phosphorylation HER GRB P P SOS RAF PI3K RAS STAT Voie PI3/AKT MEK Voie STAT Voie RAS/MAPK PTEN AKT MAPK Transcription de gènes Progression du cycle cellulaire Cycline D1 ADN Myc Cycline D1 Jun/Fos 2) La cascade signalisation Mutations de KRAS, BRAF, MEK, STAT PI3K etc… Myc Maturation Vs Prolifération Survie vs Apoptose Angiogénèse Métastase

Les thérapies ciblant la transduction du signal par les récepteur HER Anticorps anti-récepteur Molécules inhibitrices de l’activité tyrosine kinase Ligand P Induction de l’apoptose Couplage Ligand-Toxine Ligand P Ligand EGFR, HER2 HER3, HER4 Noonberg S.B. and Benz C.C. Tyrosine kinase inhibitors targeted to the epidermal growth factor receptor subfamily. Drugs 2000; 59 (4): 753-767 Bridges A.J. The rationale and strategy used to develop a series of highly potent, irreversible, inhibitors of the epidermal growth factor receptor family of tyrosine kinase. Curr. Med. Chem. 1999; 6 (9): 825-43 Uckun F.M. et al. Cytotoxic activity of epidermal growth factor-genistein against breast cancer cells. Clin. Cancer Res. 1998; 4: 901-12 Ciardiello F. and Tortora G. A novel approach in the treatment of cancer: targeting the Epidermal Growth Factor Receptor. Clinical Cancer Research. 2001; 7: 2958-70 P P TKi Blocage de la transduction du signal

Les thérapies ciblant la transduction du signal par les récepteur HER hmAc inhibiteur Stratégies d’inhibition Ac monoclonaux humanisés Inhibiteur des Tyrosine-Kinases TKi TKi Noonberg S.B. and Benz C.C. Tyrosine kinase inhibitors targeted to the epidermal growth factor receptor subfamily. Drugs 2000; 59 (4): 753-767 Bridges A.J. The rationale and strategy used to develop a series of highly potent, irreversible, inhibitors of the epidermal growth factor receptor family of tyrosine kinase. Curr. Med. Chem. 1999; 6 (9): 825-43 Uckun F.M. et al. Cytotoxic activity of epidermal growth factor-genistein against breast cancer cells. Clin. Cancer Res. 1998; 4: 901-12 Ciardiello F. and Tortora G. A novel approach in the treatment of cancer: targeting the Epidermal Growth Factor Receptor. Clinical Cancer Research. 2001; 7: 2958-70 Prolifération Invasion Métastase Inhibition de l’apoptose Angiogénèse

Inhibiteurs des récepteurs de la famille HER 1) La Ac monoclonaux humanisés et les inhibiteurs des Tyrosines kinase Trastuzumab (Herceptine™) Cetuximab (Erbitux) HER2 HER2 EGFR K. du sein K du Poumon K. du sein K. Colon K. Poumon HER4 EGFR EGFR Lapatinib (Tykerb/Tyverb) CI-1033(Canertinib) Les Tkis de dernière génération Objectif: cibler les anomalies des Récepteurs Mutation EGFR  Activation constitutionnelle en absence de ligand. Les nouvelle molécules cible les récepteurs porteurs de mutations Erlotinib (Tarceva™) K. Poumon K. Pancréas EGFR EGFR Gefitinib (Iressa™) K. Poumon

Molécules en développement William Pao & Juliann Chmielecki Nature Reviews Cancer 10, 760-774 (November 2010) Molécules en développement ATU mélanomes V600E BRAF 1ère étude K. Poumon Intérêt dans K. Colon EGFRR KRASmut Myélome