Devenir des peptides bioactifs issus de la digestion gastro-intestinale des protéines alimentaires Juliette Caron Directeur de thèse : P. Dhulster Encadrants : B. Cudennec, R. Ravallec Université de Lille1, EA 7394, USC 1281 - Institut Charles Viollette – Equipe ProBioGem 19/01/2016

Contexte du projet : digestion GI des protéines et prise alimentaire Tractus gastro-intestinal : système clé de la régulation de la prise alimentaire Communication cerveau-intestin via hormones et signaux neuronaux Digestion des protéines : libération d’acides aminés libres et de peptides  Interaction avec l’environnement gastro-intestinal Peptides bioactifs : activité biologique à visée bénéfique pour la santé  Recherche de peptides impliqués dans la régulation du métabolisme énergétique Larder and O’Rahilly (2012)  

Objectifs du projet Identifier les peptides libérés lors de la digestion in vitro GI de l’hémoglobine bovine Mettre en évidence des activités biologiques et identifier les peptides impliqués Comprendre les mécanismes d’action des peptides bioactifs Digestion GI statique in vitro Hémoglobine bovine Hydrolysats gastriques et intestinaux Revoir le cadre pour la partie analytique mettre des animations pour les points Identification des peptides LC-MS-MS Sécrétion d’hormones satiétogènes CCK, GLP-1 Inhibition de l’activité de l’enzyme DPP-IV Passage d’une barrière de cellules intestinales

1. Cartographie peptidique de la digestion de l’hémoglobine Séparation des peptides par techniques chromatographiques : HPLC, FPLC. Identification des séquences par LC-MS-MS et cartographie du recouvrement de la protéine Mise en évidence de zones résistantes Modèle in vitro Bouche 5min pH 6.5 Estomac 2h pH 2.5-3 Intestin pH 7-7.5 T=37°C Pepsine G4 chaine alpha : 131 séquences Pancréatine I4 chaine alpha : 121 séquences Appareil utilisé? Chromatogrammes? Sources : Vertsantvoort et al, 2005. Plus de 1000 séquences identifiées en phase intestinale

2. Activités biologiques : sécrétion d’hormones intestinales Cholécystokinine : hormone satiétogène sécrétée principalement au niveau du duodénum Fractionnement par FPLC intestin estomac salive PM<1000 Da Fraction FDE Fraction FC Riche en AA aromatiques Intestin 120min

2. Activités biologiques : hormone intestinale et DPP-IV GLP-1 : hormone incrétine satiétogène rapidement inactivée par l’enzyme DPP-IV Fraction F4 : potentiel inhibiteur DPP-IV / stimulateur GLP-1 GLP-1 intestin estomac salive Fractionnements analytiques Inhibition DPP-IV

2. Passage de la fraction sur barrière de cellules Caco-2 Passage de la fraction F4 d’un modèle de barrière intestinale Fraction F4 Protein Sequence Mass (Da) HBA_BOVIN ADKGNV 602.3024 ADKGNVK 730.3973 SAADKGNV 760.3715 SAADKGNVKA 959.5035 DLHAH 591.28 SDLHAHK 806.4035 HBB_BOVIN SDLHAH 678.3085 DLSHGSAQ 813.3617 KAAVT 488.2958 MNNPK 602.2846 SLDK 461.24 VAAA 330.19 VDPVN 542.27 VGGHAAE 639.2976 YGAE 438.175 YGAEA 509.2122 ANVST 490.2387 LTAEEK 689.3596 Identification LC-MS-MS apical Cellules Caco-2 sur inserts basolatéral Plus d’une centaine de séquences peptides présents dans la fraction initiale, une trentaine détectées en basolatéral Maintien de l’activité DPP-IV des surnageants apical et basolatéral

Conclusion générale Hydrolysat intestinal Protéines alimentaires Tractus GI Hydrolysat intestinal Biodisponible dans le lumen Identification des populations peptidiques Outils analytiques Activités biologiques Tests in vitro, lignées cellullaires Validation in vivo?