Papillomaviridae Papillomavirus Humains HPV Bases cellulaires et moléculaires de l’infection et de l’oncogénèse Gilles Duverlie

Pouvoir Pathogène bénin des Papillomavirus Verrues Papillome Laryngé Evolution vers le cancer dans certains cas: cancer du col de l’utérus Condylomes (crêtes de coq): IST

Animaux infectés par un Papillomavirus

PV0 : 200.106 années?

Papillomaviridae & HPV Infectent les Mammifères et les Oiseaux CRPV : Lapin cottontail BPV Bovin, etc… Barrière d’Espèce stricte Les HPV sont strictement humains L’Homme ne s’infecte pas avec les PV animaux Coévolution avec l’Hôte Etude de migrations humaines (id HBV et autres…)

Human Papillomaviruses Short Story • 1842 : Rigoni-Stern reports that prostitutes in Verona have much higher incidence of cervical cancer than nuns (STI 1928 : Georgious Papanicolaou develops the “Pap smear” for microscopic detection of cervical cancer and pre-cancer • 1951: George Otto Gey establishes in vitro culture of HeLa (Henrietta Lacks) cells derived from a lethal cervical cancer • 1983 : Harald zur Hausen discovers new HPV types (types 16 and 18) lurking in HeLa cells and other cervical cancer cells. • 2008 : Harald zur Hausen wins Nobel Prize for his work establishing a causal link between HPVs and cervical cancer

Généralités Structure

Papillomavirus Petits virus nus Icosaédriques 60 nm Sans Enveloppe 72 capsomères 60 nm Sans Enveloppe DNA/2 circulaire 8kb 8000 paires de base

Papillomavirus humains > 160 types HPV Strictement épithéliotropes Ubiquitaires dans la population ≈ 80% a eu un contage HPV Incubation : 6 semaines à 8 mois Le plus souvent Asymptomatique, commensal Certains types d’HPV provoquent des verrues ou des condylomes D’autres sont en cause dans des cancers épithéliaux : HPV haut risque : 16,18,45, etc…)

Caractéristiques importantes des HPVs Virus Résistant Eau de Javel diluée Froid , Congélation (Azote liquide) Cuisson (60-80°C quelques minutes) La cellule infectée est souvent la seule détruite lors des traitements : Risque de Dissémination Pas de Système de Culture Cellulaire simple Pas de Phénotypage en diagnostic Pas de Sérotypage (protection) vs Génotypage Pas de Modèles Animaux faciles pour HPV

Papillomavirus Virion • Non-enveloped icosahedral shell formed by 72 pentamers of a single protein, L1 : basis of current HPV vaccine • 60 nanometer diameter • A second capsid protein, L2, is present at up to 72 copies (basis of future HPV vaccine?) • Many features in common with polyomaviridae (e.g., SV40), but the two families probably never shared a common viral ancestor

HPV Genome Electron micrograph of an SV40 minichromosome (bar : 100nm). Griffith et al., 1975 10, 100 à 1000 HPV épisomes par cellule Minichromosomes avec histones cellulaires

Gènes des Papillomavirus Humains

Taxonomie

Taxonomie des Papillomavirus

Analyse Phylogénétique et Taxonomie Outil de Classification

Classification des HPVs & Tropisme Skin, hair follicles mostly commensal foot warts 70% of cervical cancers 90% of genital warts HPV16 HPV18 HPV6&11 genital mucosa, cancer- associated hand warts genital warts

Cycle viral

Composants du Cycle viral HPV Virion : ADN/2 circulaire + Capside L1+L2 Cellule infectée « normale » ADN/2 circulaire (épisomal) mRNA viral Protéines Structurales & NS : L1,L2, E2 à E7 Evolution de l’infection à suivre…

HPV entry furin Day et al (2009) PNAS 106:20458 Infection of mouse female genital tract reveals that PV attaches to heparan sulfate on the basement membrane where Nab can recognize L1-L2 before they recognize their cellular receptor (unknown at present). furin Day et al (2009) PNAS 106:20458 20

Multiplication des Papillomavirus

HPV episome attachment to Cell chromosomes Episomal Amplification : 10, 100, 1000, … increases HPV mRNA expression 

HPV Replication & Integration

Particle Assembly in the Nucleus

Structural Protein Synthesis Assembly & Capsid Maturation Less mature More mature Many Hours • Maturation requires formation of extensive disulfide crosslinks between L1 molecules. • Mature capsid is very stable (bovine papillomaviruses vs fence posts) • Hypothesis: conserved, neutralizable motifs on the virion surface may become buried during maturation to hide them from B cells / antibody recognition.

Cycle viral HPV & Différenciation cellulaire

Cycle HPV & Cell Differenciation microwound

HPV Gene Expression & Keratinocyte Differenciation

HPV & Epithelia : All are not the same

HPV Types : All are not the same Phenotypic differences

Cellular Oncogenesis

HPV infection & CIN1

HPV infection & CIN2

HPV infection & CIN3

HPV infection ……. Invasive Carcinoma

HPV is a Necessary Cause of Invasive Cervical Cancer Worldwide HPV is a Necessary Cause of Invasive Cervical Cancer Worldwide . Walboomers et al. 1999

& predictive value of worst disease in follow-up. HPV Type at enrollment & predictive value of worst disease in follow-up. Schiffman M et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2011;20:1398-1409

HPV 16 vs other HR HPV types Cumulative probability of ≥CIN3 stratified by HPV test results. Schiffman M et al. 2011 Schiffman M et al. 2011

Koilocytosis before Transformation

Koïlocyte & HPV Koilocytosis: a cooperative interaction between E5 & E6 oncoproteins. Krawczyk et al., Am J Pathol. 2008,173(3):682-8 Flèche blanche : grossissement du noyau Flèche verte : large vacuole perinucléaire Flèche noire épaississement du cytoplasme Barre : 10 µm

Molecular Oncogenesis

HPV Genome Integration & Oncoproteins HPV DNA Integrated ≠ mRNA Human papillomavirus (HPV) genome organization. (A) The HPV16 genome is shown as a black circle; arrows indicate the early (E; black) and late (L; red) promoters in the long control region (LCR). Early (E) and late (L) open reading frames (blue) are expressed at different stages during epithelial differentiation. (B) Schematic representation of the minimal HPV sequences integrated into a host chromosome. Integration is a frequent event during malignant progression of high-risk HPV-associated lesions. Expression of the HPV E6 and E7 oncoproteins from the viral LCR is universally maintained in HPV-associated cervical cancers, whereas other portions of the viral genomes, including the E5 oncoprotein, are generally no longer expressed after integration. (C) Schematic representation of the HPV16 E5 (top), E6 (middle), and E7 (bottom) oncoproteins. Sequences involved in targeting known cellular proteins that are relevant for cellular transformation are indicated as red boxes (C, cysteine; L, leucine; Y, tyrosine; E, glutamic acid; X, any amino acid). The cysteine-rich sequence in E5 (CXXC) aids in formation of homodimers. The cysteine-rich domains (CXXC-X29-CXXC) in E6 and E7 are evolutionarily related and function as zinc-binding domains. The amino terminal domain of the E7 oncoprotein that shares sequence similarity to the adenovirus early 1A protein (Ad E1A) and simian vacuolating virus 40 large tumor antigen (SV40 TAg), which contains the binding site for the retinoblastoma tumor suppressor protein (pRB), is also shown. See Introduction and Oncogenic Activities of High-Risk HPVs for details. TM, transmembrane domain. Hellner K , Münger K JCO 2011;29:1785-1794

HPV Oncoproteins & Cervical Cancer

Cellules infectées HPV : Dysplasie et Cancer Evolution de l’Expression HPV ? ADN/2 circulaire (épisomal) Nombre de copies augmente l’expression mARN et protéines Nombre de copies augmente la probabilité d’intégration Surexpression ARNs et Protéines virales ADN viral intégré (tout ou partie, exprimé ou non) Pas de hot-spots d’intégration : recherche systématique difficile Séquençage haut-débit, deep sequencing ? mRNA de fusion avec expression de protéines virales Séquences variables et pas indispensables … Surexpression possible mais pas systématique Expression indispensable ou non suivant la lignée cancéreuse Pas systématique non plus

HPV Immunology

Réponse Immunitaire faible sans Inflammation…

Dysplasia & Inflammatory Response in HPV-induced carcinogenesis Boccardo E et al. 2010

Viral-Like Particles of HPV

Séroneutralisation HPV in vivo

VLP Vaccines

Taux d’Anticorps & Neutralisation HPV

Transsudation vs Exsudat Inflammatoire

HPV L1 Some Degree of Cross-Protection? partial no HPV45 yes (weak?) HPV16 “high risk” types HPV18 Harper (2006) Lancet 367:1247

L2-Neutralization - Chop the Whole Tree? cutaneous, mostly asymptomatic foot warts HPV16, 31 HPV18 CRPV HPV6, 11 neutralization BPV1 Immunogen: BPV1 L2 aa 1-88 genital mucosa, cancer- associated hand warts Richard Roden Diana Pastrana (2005) Virol 337:365 genital warts 54

Frottis cervico-utérin FCU Dépistage & prévention du cancer du col de l’utérus En France 3300 nouveaux cas/an, 1000 décès Associé à HPV dans ≥99,5% des cas ASCUS : Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance Justifie une recherche des HPV oncogènes (hybridation, PCR) Classification CIN : Cellular Intraepithelial Neoplasia CIN I, CIN II, CIN III, CIN IV, carcinome in situ Suivi FCU tous les trois ans de 25 à 65 ans Politique vaccinale HPV avant activité sexuelle en évolution

PAPILLOMAVIRUS Place essentielle de la biologie moléculaire: Diagnostic : Place essentielle de la biologie moléculaire: Hybridation par sonde PCR ADN Typage par hybridation Traitement: Podophylline, Imiquimod® Cryothérapie (azote liquide détruit les ¢, pas les virus!) évaporation laser; exérèse chirurgicale; électro- coagulation

Conclusions Les Papillomavirus ont co-évolué avec leur hôte : 200 Ma ! Résistance au froid et au chaud … Spécificité de tissu : épithélium cutané ou muqueux Les HPVs génitaux muqueux (IST) sont une condition nécessaire au développement d’un carcinome cervical… Politique de Prévention du K du col par Dépistage et Vaccination Suivi et traitement des Dysplasies (et autres infections à HPV) Lente Evolution avec Taux de mutation faible ≈ 10-9 Risque faible d’échappement aux vaccins ? Franchissement de la barrière d’espèce ? (difficile) Par rapport au Vaccin : Faible probabilité de remplacement rapide d’un type par un autre ? Surveillance épidémiologique nécessaire…