METHODES DE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE

INTERET DIAGNOSTIC: Preuve de l’origine virale de l’infection   Preuve de l’origine virale de l’infection Suivi de l’évolution biologique de l’infection Evaluation de l’état immunitaire d ’un patient Appréciation de la réponse vaccinale Eviter la transmission de virus au cours de dons d ’organes Etude du virus en cause et de ses variants

Validation biologique ETAPES DU DIAGNOSTIC  Prélèvement Phase pré-analytique Phase analytique Validation technique Validation biologique Edition du résultat

Prescription médicale PHASE PRE-ANALYTIQUE Prescription médicale Prescripteur OBLIGATOIRE Patient: Nom/Prénom/Sexe/Date de naissance/… Renseignements complémentaires But de l'analyse Nature des principales manifestations pathologiques Date d'apparition Localisation des lésions infectieuses Etat d'immunodépression Prise d'antiviraux, ATB Femme enceinte / date début de grossesse Voyage récent Vaccination datée…

PHASE PRE-ANALYTIQUE 1) Exécution du prélèvement La fiabilité du diagnostic dépend de la qualité du prélèvement Le préleveur doit être clairement identifié: responsable de l'étiquetage des récipients contenant l'échantillon biologique 2) Récipients contenant les prélèvements Transport dans un sac en plastique Prescription jointe dans un compartiment séparé 3) Moment du prélèvement Infection aiguë: début des manifestations cliniques Mise en évidence d'une primo-infection: période d'incubation habituelle

PHASE PRE-ANALYTIQUE 4) Sites des prélèvements En théorie: toute lésion accessible doit être prélevée Utile de prélever différents sites, correspondant à la porte d'entrée habituelle du virus, et sa voie d'élimination Détection rapide de virus, culture de virus, recherche de génomes viraux (ARN++): TRANSPORT SANS DELAI AU LABORATOIRE Congélation sous 4 heures du plasma ou sérum Mauvaises conditions de transport du prélèvement: Risque d'altération des cellules infectées Perte de pouvoir infectieux du virus (cultures faussement négatives) Dégradation des génomes viraux (PCR faussement négative, sous-estimation de la charge virale) Risque de prolifération bactérienne ou mycosique

PHASE PRE-ANALYTIQUE 5) Circonstances justifiant un refus d'analyse par le laboratoire Le biologiste est responsable des échantillons biologiques acceptés au laboratoire. Principales situations de refus: Echantillon non étiqueté ou improprement étiqueté Echantillon inapproprié aux analyses prescrites Echantillon reçu dans un récipient endommagé et/ou non étanche Echantillon reçu trop tardivement après avoir été prélevé Echantillon identique à un autre échantillon reçu le même jour*

PHASE ANALYTIQUE / METHODES UTILISEES Diagnostic direct Diagnostic indirect Mise en évidence du virus De la particule complète D’antigènes viraux De génomes viraux D’une propriété virale Mise en évidence de la réponse spécifique de l’hôte Anticorps (IgG, IgM) Synthèse d’Interféron

Diagnostic Direct Recherche d’antigènes viraux Sur l’échantillon biologique Après mise en culture cellulaire Recherche de virions Microscopie électronique Recherche d’antigènes viraux ImmunoFluorescence (Ag associés aux cellules) Enzyme ImmunoAssay, agglutination (Ag solubles) Recherche de génomes viraux PCR, hybridation moléculaire, TMA, bDNA, ...

Recherche d’antigènes viraux Diagnostic Direct Sur l’échantillon biologique Après mise en culture cellulaire Recherche de virions (rare) Microscopie électronique Recherche d’antigènes viraux ImmunoFluorescence (Ag associés aux cellules) Enzyme ImmunoAssay, agglutination (Ag solubles) Recherche de génomes viraux PCR, hybridation moléculaire, TMA, bDNA, ...

Recherche d’antigènes viraux Diagnostic Direct Recherche de virions Microscopie électronique Recherche d’antigènes viraux IF (Ag associés aux cellules) EIA, agglutination (Ag solubles) Recherche de génomes viraux PCR, hybridation moléculaire, TMA, bDNA, ...

Microscopie électronique Appliquée à la recherche de virus non cultivables Détection du virus entier Coloration négative HSV Rotavirus

Diagnostic direct Recherche de virions Recherche d’antigènes viraux Microscopie électronique Recherche d’antigènes viraux ImmunoFluorescence (IF) (Ag associés aux cellules) Enzyme Immuno Assay (EIA), agglutination (Ag solubles) Recherche de génomes viraux PCR, hybridation moléculaire, TMA, bDNA, ...

Types de prélèvements - Virus concernés Selles Rotavirus; Enterovirus Adenovirus; Astrovirus Sécrétions respiratoires Virus grippaux VRS; parainfluenza Adénovirus Lésions cutanéo-muqueuses HSV 1, 2 VZV Sang polynucléaires sérum CMV (pp65) AgHBs Ag Hbe Ag delta Ag p24

Intérêts et limites de la détection d’antigènes viraux Détection directe d'antigènes viraux ne nécessite pas le maintien de l'infectiosité. (IF, agglutination latex) Limites: manque de sensibilité; nécessité de quantités importantes de virus Champs d'application: restreint aux prélèvements riches en matériel infectieux, intérêt: bonne conservation des structures antigéniques, le prélèvement peut être conservé à 4°C.

Détection des antigènes viraux Immunofluorescence (IF): IFD directe ou IFI indirecte IFI IFD Antigènes viraux Anticorps spécifiques Anticorps spécifiques marqués à la fluoresceïne Anticorps secondaires marqués à la fluoresceïne

IFD Ag pp65 CMV VRS

Immunochromatographie: tests rapides Influenza virus Virus Respiratoire Syncytial … Bande Témoin de la réaction Bande spécifique

Agglutination: Virus des gastroentérites Agglutination négative Rotavirus Adenovirus Norovirus … Agglutination négative Agglutination positive

Diagnostic Direct Recherche de virions Recherche d’antigènes viraux Sur l’échantillon biologique Après mise en culture cellulaire Recherche de virions Microscopie électronique Recherche d’antigènes viraux IF (Ag associés aux cellules) Enzyme ImmunoAssay, agglutination (Ag solubles) Recherche de génomes viraux PCR, hybridation moléculaire, TMA, bDNA, ...

Isolement sur Culture Cellulaire Isolement du virus sur culture cellulaire:  TECHNIQUE DE REFERENCE Identification virale : lecture de l ’Effet CytoPathique (ECP) Typage du virus (entérovirus, Herpes simplex virus) Obstacles limitant l ’intérêt de la culture: Délai de réponse important Nécessité de disposer de nombreuses lignées cellulaires (coût) Prélèvements riches en virus infectieux (acheminement rapide)

Cultures virales #1 Inoculation de cellules permissives Cellules diploïdes (MRC5) Lignées continues (Vero, hela, Hep2, MDCK, …) Historique : souriceau, œuf embryonné, … Manipulation stérile Matériel adapté Manipulateur expérimenté

Cultures virales #2 En pratique Acheminement rapide Traitement de l ’échantillon Directe si stérile Traitement : filtration, isolement cellulaire, broyage, antibiotiques, … Inoculation d’un panel adapté de cellules ± centrifugation

Cultures virales #3 En pratique Incubation 37°C (33°C), CO2 Mise en évidence de la multiplication virale Effet cytopathique (ECP) Contraste de phase Coloration ImmunoFluorescence (IF), ImmunoPeroxydase (IP) sur cellules Biologie moléculaire

Culture du Cytomegalovirus (CMV) #1 ECP lent 15 à 21 j Déformation de la nappe en banc de poissons ECP Cellules MRC5 Tapis cellulaire non infecté

Culture de l’Herpes Simplex Virus ECP rapide en 24-48 h Ballonisation des cellules et décollement Confirmation par IFD Typage HSV-1 et 2 par IFD HSV-2 HSV-1

Intérêts et limites de la culture virale Isolement viral: Intérêts faire la preuve du caractère infectieux des virus présents dans le prélèvement pour établir le diagnostic étiologique de certaines infections virales étudier leur résistance phénotypique aux antiviraux disponibles réaliser des enquêtes épidémiologiques Quand prélever: le + précocement possible Ou prélever: au niveau de l'organe cible quand les lésions sont accessibles

Intérêts et limites de la culture virale Interprétation des résultats: * Succès d'un isolement dépend de la qualité du prélèvement, des cellules, du titre infectieux et du caractère cultivable du virus. * Risques d'échec sont nombreux, la négativité des cultures ne permet pas d'éliminer formellement une infection virale. * Présence d'un virus dans un prélèvement est significative de son implication dans la pathologie observée (ex: entérovirus dans le LCR, HSV dans liquide vésiculaire); exception pour certains Herpesviridae excrétés de façon intermittente ou chronique.

Recherche d’antigènes viraux Diagnostic Direct Recherche de virions Microscopie électronique Recherche d’antigènes viraux IF (Ag associés aux cellules) EIA, agglutination (Ag solubles) Recherche de génomes viraux PCR, PCR temps réel, hybridation moléculaire, TMA, bDNA, ...

Recherche des Génomes Viraux Détection des génomes Quantification des génomes Séquençage des génomes Techniques automatisées ++ Très sensibles et rapides

TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE Mise en evidence du génome viral: Techniques d ’hybridation Amplification du signal: bDNA (ADN branché) Amplification de la cible: PCR TMA (Transcription Mediated Amplification) Quantification en temps réel Etudes génotypiques: Génotypage de la souche virale: ex du VHC (LiPA; Séquençage; …) Génotypage de résistance: ex du VIH, du VHB

Principes de l’hybridation Sonde marquée Génome viral Support solide Hybridation simple Hybridation sandwich Hybridation par compétition

Techniques d’amplification Basées sur la réplication PCR, ... Basées sur la transcription TMA, ...

DÉTECTION DES ACIDES NUCLEIQUES TMA PCR bDNA Cible ARN ou ADN Ajouter primers & enzymes Copies (ARN) Copies (ADN) 1 sonde de détection par copie 1 sonde de détection par copie amplifiée Plusieurs sondes de détection par cible Ajouter sondes et ADN branché Virus, bactérie ou cellule

Intérêts et limites de la virologie moléculaire La détection des acides nucléiques n'est pas synonyme d'infectiosité stricto sensu. AVANTAGES INCONVENIENTS Grande sensibilité Grande spécificité Quantification de la charge virale Nombreux tests commercialisés Equipement Temps de réalisation Risques d'inhibiteurs

PCR: Polymerase Chain Reaction

PCR quantitative en temps réel Mesure en phase exponentielle

Chimie Taqman® A. R Q Activité 5’ nucléase de l’ADN polymerase Excitation R Q POL 3 ’ 5 ’ 3 ’ 5 ’ POL Activité 5’ nucléase de l’ADN polymerase Utilisation d’une sonde doublement marquée (Récepteur et Quencher) Mesure de fluorescence: Etape d’élongation

B. R Q 5 ’ 3 ’ Excitation POL F

C. R Q 5 ’ 3 ’ POL Excitation F

Représentation schématique de courbes de fluorescence Intensité de fluorescence seuil Cx Cy Nombre de cycles

Applications de la BM Diagnostic Suivis thérapeutiques /évolutifs Rapide / urgent Pas de culture possible Recherche d ’Anticorps inutile (n-né) Cas difficile Suivis thérapeutiques /évolutifs Quantification Autres Typage / génotypage de résistance Variabilité virale

Interprétation des résultats Faux négatifs Mauvais prélèvement Mauvaise extraction Inhibiteurs (héparine, hémoglobine, …) Faux positifs Contaminations par des amplicons Orientation clinique +++

Phase analytique / Méthodes utilisées Diagnostic direct Diagnostic indirect Mise en évidence du virus De la particule intégrale D’antigènes viraux De génomes viraux D’une propriété virale Mise en évidence de la réponse spécifique de l’hôte Anticorps (IgG, IgM) Synthèse d’Interféron

Diagnostic Indirect Mise en évidence de la réaction immune de l’hôte Anticorps Sérum ou autres liquides Recherche Séroconversion Augmentation des IgG Présence d ’IgM Avidité des IgG

Recherche des Ac totaux Séroneutralisation Agglutination Hémagglutination Inhibition de l ’hémagglutination Immuno-fluorescence indirecte Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA) Simple Compétitif Sandwich Immunocapture Techniques de référence de moins en moins utilisées

Intérêts et limites de la sérologie virale Recherche des Anticorps synthétisés par l'hôte en réponse à une infection virale aiguë, persistante ou ancienne. Méthodes utilisées: techniques sérologiques basées sur la spécificité antigène-anticorps. Technique ELISA classique Echantillons: sérum, plus rarement plasma, LCR, liquide amniotique. Transport des échantillons ne demande pas de conditions particulières sauf une décantation dans un délai de 24 - 48 heures pour éviter la survenue d'une hémolyse.

PRELEVEMENTS BIOLOGIQUES Prélèvements pour la recherche des anticorps  Sérodiagnostic / SERUM (sur tube sec) Signes cliniques IgG IgM Titre des anticorps 1er sérum 2ème sérum Contage J0 6 jrs Durée

Cinétique des Ac Réactivation Réinfection IgG taux IgG IgM IgM? temps Primo-infection

Antigènes viraux fixés SERODIAGNOSTIC Techniques immuno-enzymatiques ELISA: enzyme linked immunosorbent assay  Technique très sensible et reproductible Etape 1 Antigènes viraux fixés sur une cupule + Sérum patient Etape 2 Ac se fixent sur les Ag Lavages Etape 3 Fixation des Ac secondaires Etape 4 Coloration + conjugué + Substrat

Techniques EIA

ELISA VIH

Immunoblot Western blot: gp160 gp120 p24 Membrane nitrocellulose Sérum patient Substrat Lecture des bandes Conjugué

Immunoblot VIH type 1 et 2

Intérêts et limites de la sérologie virale Circonstances cliniques Détermination du statut immunitaire vis à vis d'un virus donné Evaluation de l'immunité résiduelle après infection naturelle ou vaccinale Diagnostic d'une infection en cours ou récente par la mise en évidence d'une augmentation significative du titre d'anticorps ou d'une séroconversion (recherche d'IgM) Inconvénients Fenêtre sérologique (HCV< 70 jrs; HIV< 22 jrs,…) Impossibilité d'exclure une étiologie virale Réactions faussement positives (sensibilité des tests, mécanismes immunitaires) Situations compliquant l'interprétation: Administration passive de gammaglobulines Hémodilution Etats dysimmunitaires

Intérêts et limites de la sérologie virale Avidité des IgG: utilise l'existence d'une maturation de la réponse immunitaire humorale: augmentation de l'affinité intrinsèque paratope/épitope). La détermination de l'avidité (affinité fonctionnelle) des IgG permet de distinguer primo-infection et infection ancienne. Mesure par ELISA le degré relatif de dissociation spécifique du complexe immun par l'action d'un agent dénaturant (urée).

Avidité des IgG taux Ag viraux IgG 90-100% Avidité IgM Primo-infection temps

Conclusion Toujours privilégier le diagnostic direct Conditions de prélèvement +++ Renseignements cliniques Automatisation Sérologie +++ Biologie moléculaire ++