Examens complémentaires en hématologie F hématologie cellulaire

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1 Examens complémentaires en hématologie F hématologie cellulaire
En pratique F hématologie cellulaire F hémostase

2 Examens complémentaires en hématologie
F hémogramme F numération des réticulocytes F fer sérique, transferrine et ferritine F électrophorèse de l’Hb, test de Coombs, dosages vitaminiques F méthodes isotopiques in vivo F immunophénotypage des cell. Sanguines F myélogramme/biopsie médullaire F adénogramme/biopsie ganglionnnaire F caryotype/réarrangement des gènes des Ig et du TCR /recherche de translocations en biologie moléculaire

3 Examens complémentaires en hématologie
hémogramme F Quand?  bilan systématique -pré-opératoire -1ère hospitalisation  Bilan orienté - pâleur, dyspnée, amaigrissement, fièvre inexpliquée, adénopathies,  VS… F Comment? prélèvement: veineux, jeun non obligatoire ne pas prélever dans tubulure de perfusion (dilution), à distance des intra-lipides (interférence avec leucocytes) à adresser à t°ambiante en – de 6H F Conditions de réponse: fonction de l’urgence clinique, distance du laboratoire, horaire des ramassages… 20 mn à 6H

4 Examens complémentaires en hématologie
hémogramme Technique : automates utilisant 2 paramètres principaux  comptage électronique des particules,  diffraction d’un rayon laser à petit et grand angles (volume, densité du contenu de la cellule è GR hypo/hyperchromes), +/- techniques cytochimiques (évaluation du contenu en peroxydases des granuleux et monocytes) +/- techniques de fluorescence (densité du noyau, contenu en ARN du cytoplasme ex lymphocytes activés) F Systèmes d’alarmes de + en + précises quanti/qualitatives détectant les incertitudes de l‘automate les microcytes peuvent être comptés comme des plaquettes les grosses plaquettes comme des leucocytes GR décomptés comme leucocytes ds certaines conditions gouttelettes lipidiques décomptées comme des GB

5 Examens complémentaires en hématologie
hémogramme F valeurs automatisées -mesurées (réponse dans 1/2 journée): ü numération des GR, des GB et des plaquettes ü taux d’hémoglobine ü volume globulaire moyen et indice de distribution (CVGR<15%) - calculées: TGMH* (Hb/nbre GR) *TCMH ou HCM mesurée particule/particule è % GR hypochromes hématocrite ( GRxVGM)- CCMH (Hb/Ht) pas d ’intérêt clinique ü formule leucocytaire en valeur absolue - 5 catégories leucocytaires Gr N, Eo, B; Ly; Monocytes - détection de cellules anormales +/- fiable ss forme d’alarmes F toute anomalie quantitative/qualitative détectée par l’automate génère des alarmes è étude morphologique des éléments figurés sur lame è réponse dans journée

6 Examens complémentaires en hématologie
hémogramme étude morphologique des éléments figurés sur lame ü étalement automatisé ou manuel d ’une goutte de sang et coloration de MGG ü décompte de 100 leucocytes F morphologie des GR, détection d’érythroblastes à décompter du nombre de GB si nombreux (comptés par plupart des automates comme GB) F morphologie des leucocytes et détection des cellules anormales (myélémie, blastes, cellules lymphomateuses..) F morphologie plaquettaire et détection d’éventuels agrégats plaquettaires (fausses thrombopénies) F sur certains automates, détection automatisée des érythroblastes et de la myélémie

7 hémogramme Examens complémentaires en hématologie
Numération globulaire normale en fonction de l ’âge et du sexe Homme Femme Enfant Nourrisson Nouveau-né 3-12ans 3 mois-1an Nombre de GR 1012/l Hb (g/dl) VGM (fl) TGMH (pg) Hématocrite (l/l) CCMH (g/dl) Nombre de GB 109/l neutrophiles éosinophiles basophiles lymphocytes monocytes Plaquettes 109/l

8 Examens complémentaires en hématologie Anomalies des Globules rouges
F valeurs automatisées : -numération des GR -taux d’hémoglobine fausses anémies par hémodilution (grossesse, splénomégalie, composant monoclonal IgM très élevé) fausses polyglobulies par hémoconcentration (grands brûlés) anémies masquées par hémoconcentration (déshydratation) -volume globulaire -TGMH calculé Anémie Hb < g/dl Polyglobulie Hb >16-18 g/dl Microcytaire <80 fl normo/macrocytaire fl CVGR >15% distribution anormale du volume des Gr Hypochrome<27pg Normochrome 27-33 * TCMH ou HCM mesurée particule/particule è% de GR hypochromes è détection précoce d’une carence en fer avant modification de la valeur moyenne globale

9 Anomalies leucocytaires et plaquettaires
Examens complémentaires en hématologie Anomalies leucocytaires et plaquettaires F Neutropénie en valeur absolue < 1.8 G/L ou 109/l - sévère si < 1 - agranulocytose si < 0.5 (urgence diagnostique) Polynucléoses > 8 +/- myélémie (+/- importante) F Hyperlymphocytoses > 4 G/L ou 109/l - réactionnelles - tumorales Cytologie +/- phénotype à confronter à l ’âge, contexte clinique (fièvre, syndrome tumoral) F Hyperéosinophilies > 0.9 G/L ou 109/l thrombopénie < 150, sévère si < 50, symptomatique si < 20 F hyperplaquettose > 600 causes multiples, > 1000 SD myéloprolifératif

10 Examens complémentaires en hématologie Numération globulaire - Rappel
paramètres mesurés Nombre de GR intérêt pratique très limité VGM exprime une moyenne  l’homogénéité ou l’hétérogénéité de la population est exprimé par l’indice de distribution (CVGR) normalement < 15% Hb mesure spectrophotométrique, peut être faussé epar opalescence du plasma ou défaut de lyse des GR paramètres calculés Ht = % de GR dans un volume de sang= GR x VGM TGMH = Hb/GR CCMH = Hb/Ht, pas d’intérêt clinique, valeur de bon étalonnage de l automate, son augmentation peut témoigner de l ’agglutination des GR (ou fausse valeur HB)

11 Examens complémentaires en hématologie Numération des réticulocytes
Quand? devant anémie normo/macrocytaire Évalue la production médullaire érythroblastique et donc le caractère régénératif ou arégénératif de l’anémie Comment? Détection de l ’ARN ribosomial des GR immatures (48H à 72H) F classiquement par bleu de crésyl brillant ou bleu de méthylène avec lecture au microscope sur 1000 GR F actuellement détection automatisée par produits fluorescents technique plus rapide et précise è % et niveau de fluorescence Valeur si < 25 x 109/l è érythropoïèse défaillante (insuff médullaire primitive ou secondaire: insuff rénale, cause endocrinienne, carences vitaminiques, envahissements) si > 110 x 109/l èérythropoïèse augmentée (anémie régénérative : hémolyse, hémorragie aigüe)

12 Examens complémentaires en hématologie
Exploration du fer Quand? ü devant une anémie hypochrome  microcytaire, avant traitement. pour le dosage du fer arrêt de Tt par le fer depuis 72H, prélèvement soigneux à jeun évitant l’hémolyse, A Savoir Ä causes principales des anémies hypochromes : carence martiale +++ thalassémie hétérozygotte +++ anémie inflammatoire +/- Ä suspecter la carence en fer avant l’anémie devant une hypochromie isolée, 1ère anomalie de la NF diminution des capacités physiques à l’effort baisse des capacités intellectuelles moins bonne résistance aux infections ü si suspicion de surcharge martiale

13 Examens complémentaires en hématologie
Exploration du fer Comment? Dosages -fer sérique, transferrine et/ou ferritine Dosage: fer sérique (13-20µmol/l), transferrine (2-3.8 g/l), et CTF 45-70µmol/L, ferritine ( µg/l chez homme, chez femme) Calcul du coefficient de saturation (CS) de la transferrine (N = 30%) interprétation d’une hyposidérémie si carence en fer: fer sériqueî CTF transferrineì CSî ferritineî si sd inflammatoire: fer sériqueî CTF transferrineî CS N ferritineì Limites ferritine: ì dans lyses cellulaires importantes, difficile à interpréter si association carence et sd inflammatoire - Récepteur soluble de la transferrine, ì en cas de carence en fer et non influencé par Sd inflammatoire - dosage de l’ hepcidine dans l’avenir? Hormone régulant l’absorption intestinale du fer et son relargage par les macrophages, hyperproduction dans l’anémie inflammatoire

14 Examens complémentaires en hématologie
Dosages vitaminiques Quand ? devant une anémie macrocytaire avant tout traitement et toute transfusion, après le myélogramme À savoir: Possibilité d’association carence vitaminique/hémopathie carence vitaminique probable si VGM > 120fl. pas d‘urgence à traiter (anémies d’installation chronique) Comment? Dosages vitamine B12 ( pg/ml) et folates sériques (5-15ng/ml),± érythrocytaires (>200 pg/ml de GR) par technique de radio-analyse Test de Coombs Quand? Devant une anémie normo/macrocytaire régénérative (réticulocytes > 120 x 109/l ), pour rechercher origine auto-immune Comment? sur sang veineux;Test direct: mise en évidence d’anticorps fixés sur les GR du patient,en ajoutant des anticorps de lapin anti-immunoglobulines humains : si test +,agglutination des GR test indirect: recherche d’AC libres dans le sérum du patient en présence d’un panel de GR portant des antigènes connus, si fixation, agglutination en ajoutant du sérum de lapin anti-Ig humaines.

15 Examens complémentaires en hématologie
Electrophorèse de l’hémoglobine Quand ? ü quand on suspecte une anomalie de l’hémoglobine de srtucture ou de synthèse En particulier devant une anémie hypochrome microcytaire , avec CVGR normal (si ìCVGR è carence en fer) et fer sérique et ferritine normal ou augmenté Comment? Sang veineux, étude de la migration des hémoglobines dans un champ électrique Normales: Hb A1 prédominante, Hb A2 < 3.5%, Hb F traces

16 Examens complémentaires en hématologie Méthodes isotopiques in vivo
F masse sanguine  quantification précise du volume globulaire par technique de dilution d’hématies du sujet marquées au Cr51 ou Te99 du volume plasmatique par albumine marquée indications Trancher entre polyglobulie vraie et fausse polyglobulie (î du volume plasmatique), anémie vraie et par hémo-dilution test de Schilling étude de l’absorption de la vitamine B12 marquée au Co58 donnée per os,après saturation des réserves hépatiques avec B12 froide, par élimination urinaire en 48H. étude du mécanisme du défaut d’absorption par ingestion de B12 marquée par un autre isotope du Co associée à du FI

17 Examens complémentaires en hématologie
immunophénotypage Quand? Caractérisation de cellules anormales dans le sang, moëlle osseuse, ganglion, liquides…., pour préciser la filiation et le niveau de différenciation cellulaire, rechercher une clonalité B et/ou un profil spécifique d’une entité donnée Comment? Mise en évidence d’antigènes membranaires ou cytoplasmiques spécifiques de lignée et/ou de différenciation cellulaire, sur sang total ou suspensions cellulaires, par techniques d’immunofluorescence et lecture en cytométrie de flux ou d’immunocytochimie En pratique: technique assez longue (1 à 3H), semi-manuelle et coûteuse indications à discuter avec le biologiste (en dehors des numérations CD4/CD8) Adresser des tubes de sang sur EDTA (tubes à NFP) sur RV

18 Cytométrie de flux Immuno-cytochimie F Rapide (1 à qques H)
F Clonalité B (restriction isotypique de l’expression des chaînes légères) F caractérisation précise des pop. tumorales par doubles, triples et quadruples marquages èprofils spécifiques (entités B) èphénotypes anormaux (T>>B) F Quantification de marqueurs Immuno-cytochimie Faible consommation cell. Corrélation marqueur/cellule Réalisation compatible avec urgence (1H avec kits commerciaux)  CD10

19 Indications préférentielles
Cytométrie de flux F Sang total, Moëlle totale, liquides, suspensions cellulaires à partir de tissus CD10 Etalements directs (adénogrammes, myélogrammes, empreintes de biopsies..) Étalements cyto-centrifugés de suspensions  Immuno-cytochimie

20 Examens complémentaires en hématologie
immunophénotypage Antigènes de la lignée T :CD2, CD3, CD5, CD4, CD8 Antigènes de la lignée B: DR, CD19, CD20, CD79, immunoglobuline Antigènes des cellules myéloïdes: CD13, CD33, myéloperoxydase Antigènes des cellules monocytaires CD14, CD11 Antigènes des cellules érythroïdes: glycophorine A Antigènes de la lignée plaquettaire : CD41, CD42 Antigènes des cellules immatures : CD34, CD117 Profils phénotypiques spécifiques : Leucémie lymphoïde chronique CD19+ CD5+ CD23+ Lymphome folliculaire CD20+ CD10+ CD5-

21 Examens complémentaires en hématologie
Explorations tissulaires - Recommandations générales F pour un diagnostic précis, rapide, économique nécessité d’une synergie clinico-biologique - donner des renseignements sur tableau clinique, antécédents familiaux et personnels, traitements éventuels - préciser si possible ce que vous attendez de l ’analyse demandée - s’informer sur modalités de prélèvement - prélever avant tout traitement - ne pas hésiter à prendre contact avec le laboratoire

22 Examens complémentaires en hématologie
myélogramme Quand? è Rechercher/éliminer une hémopathie cytopénie(s): anémie normo/macrocytaire arégénérative, neutropénie sévère, thrombopénie - hyperleucocytose, thrombocytose en dehors sd inflammatoire /infectieux polyglobulie vraie (masse sanguine ì) èbilan d’extension d’un lymphome èrecherche d’une métastase èbilan d’un composant monoclonal sérique/urinaire èbilan de fièvre prolongée, baisse de l’EG, VS augmentée sans cause infectieuse

23 Examens complémentaires en hématologie
myélogramme Comment? Ponction sternale sauf intervention chir. ou irradiation complications exceptionnelles (effraction crosse aortique), crête iliaque postérieure (moins dangereux) trocard à usage unique type Mallarmé avec garde, anesthésie locale peau +/-périoste (patch d’EMLA si hospitalisation, 30mn de délai, xylocaïne en injection s/c) Technique: Traverser table externe du sternum (pression douce si sujet âgé), puis aspiration intense et brève (douloureuse) de 1cc de moëlle maximum dans une seringue de 10cc Recueillir le maximum de grains et les écraser entre 2 lames, Éventuellement 2ème aspiration pour caryotype, culture de progéniteurs hématopoïétiques, myéloculture

24 Examens complémentaires en hématologie
myélogramme En pratique Laisser sécher les frottis à l’air, les adresser au laboratoire avec fiche de renseignements remplie soigneusement Examen des lames après coloration de May-Grünwald-Giemsa (20-45 mn), délai moyen de réponse écrite 48H, réponse orale si urgence (pour mise en route de traitement) en 2H (après l’arrivée au laboratoire!) Examens complémentaires (décidés par le biologiste) cytochimiques Présence et répartition du fer (coloration de Perls) recherche d’enzymes utiles au diagnostic des hémopathies Immunocytochimiques mise en évidence d’antigènes de surface/cytoplasmiques pour caractériser des cellules métastatiques/blastiques/lymphoïdes anormales Limites du myélogramme: moëlle hypoplasique ou avec fibrose Pas de contre-indication

25 Examens complémentaires en hématologie
Biopsie de moëlle Quand? En deuxième ligne après réalisation du myélogramme sauf - bilan d’extension d’un lymphome ou d’un carcinome, - si suspicion de myélofibrose à l’hémogramme (hématies en poire, érythroblasto-myélémie) Comment? - Asepsie +++ - préparation morphine + patch d’EMLA + AL à la xylocaïne Prélèvement d’un cylindre osseux sous anesthésie locale soigneuse à l’aide d’un trocard de Jamshidi à usage unique, enfoncé sur une longueur de 1.5 à 2 cm en crête iliaque postéro-supérieure (crête iliaque antérieure si obésité ++) Après extraction de la carotte, réaliser des empreintes sur lames, puis placer l’échantillon dans un liquide de fixation formolé. Contre-indication absolue: traitement par anti-vitamines donc relais AVK par Héparine de bas poids moléculaire

26 Examens complémentaires en hématologie
Biopsie de moëlle Résultat minimum de 72H pour avoir le résultat. Renseigne sur : F richesse et structure du tissu myéloïde (différenciant hypoplasie et fibrose, les 2 pouvant entraîner un échec du myélogramme) F présence et quantité de cellules anormales, par rapport au myélogramme - meilleure évaluation quantitative, voire détection surtout si foyers fibreux (lymphome, métastase) - moins bonne définition cellulaire donc moins bonne catégorisation des cellules anormales Myélogramme et BM complémentaires et non substitutifs

27 Ponction ganglionnaire (adénogramme)
Examens complémentaires en hématologie Ponction ganglionnaire (adénogramme) Quand? Bilan d’une adénopathie isolée ou polyadénopathie Comment? Geste peu douloureux et facile à réaliser Prélèvement de suc ganglionnaire, par aiguille de taille petite /moyenne, avec /sans aspiration, après immobilisation du ganglion entre 2 doigts, puis projection sur 1 ou plusieurs lames de verre et étalement très doux* et séchage à l’air. Si aspect purulent, renouveler l’aspiration pour étude bactériologique, avec aiguille plus grosse si pus épais. Si échec, renouveler avec aiguille plus grosse. Résultat coloration de MGG (idem myélogramme) délai moyen 48H. Réponse orale si urgence en 2H. F rassure si aspect inflammatoire banal, concordant avec clinique et/ou hémogramme, mais la persistance d’une adénopathie sans cause infectieuse prouvée è biopsie F oriente le Dg : pus (+ bactério), métastase, lymphome à confirmer par une biopsie

28 Examens complémentaires en hématologie Biopsie ganglionnaire
Quand? devant une ou plusieurs adénopathies isolées non inflammatoires, non rapidement régressives, en l’absence de contexte infectieux patent (angine, etc…) vérifier l’absence de syndrome mononucléosique si possible après ponction permettant une orientation Comment? - Geste chirurgical sous AL ou AG, ou radiologique (micro-biopsies dirigées) - Si possible ne pas faire biopser en siège inguinal Demander à biopsier l’adénopathie la plus volumineuse, si possible entière et la faire envoyer à l’état frais non fixé dans un délai de 2H maximum prévenir le laboratoire, lui adresser des informations cliniques

29 Examens complémentaires en hématologie Biopsie ganglionnaire
Techniques Au laboratoire d’hématologie empreintes pour analyse cytologique d’orientation immédiate immunophénotypage (CFM, immunocytochimie) cytogénétique / biologie moléculaire (clonalité, recherche de translocations) Au laboratoire d’anatomie pathologique coupes des blocs après inclusion en paraffine immunohistochimie (antigènes cellulaire, protéines anormales) recherche de virus ou de marqueurs géniques en hybridation in situ analyse de clonalité/recherche de translocations

30 Examens complémentaires en hématologie
caryotype Quand? è affirmer la clonalité d’une anomalie hématologique (mais la relation clonalité-malignité n’est pas absolue) è mettre en évidence des anomalies spécifiques d’une affection donnée, à visée diagnostique (LMC, certains types de lymhpomes malins), pronostique (ds leucémies aigües), ou suivi de maladie résiduelle Comment? Mise en évidence d’anomalies chromosomiques de nombre et/ou de structure (translocations, déltions, inversions…) par cytogénétique conventionnelle (dénombrement et classement des chromosomes après culture courte de 18 à 48H, bloquée au stade, métaphasique, analyse de 20 mitoses minimum) et/ou cytogénétique moléculaire par hybridation in situ fluorescente (FISH) ou peinture chromosomique, sur noyaux en métaphase ou interphase, permettant de préciser une anomalie, ou de la révéler si non trouvée sur le caryotype.

31 Jean Pierre A….– caryotype sang du 09.04.99
Clone 1: 47,XY, +3, del(7)(q31q35)

32 Examens complémentaires en hématologie
caryotype En pratique è envoi de sang (3 tubes de 5cc), moëlle osseuse (1cc) sur tubes héparinés, AVANT Tt cortico- ou chimiothérapique nécessite 20 millions de cellules, délai de réponse minimum: 3-4 jours du lundi au vendredi (avant 14H), prévenir si arrivée tardive è fragment de biopsie ganglionnaire frais non fixé pour les lymphomes malins Indications toutes les hémopathies où la cytogénétique a un intérêt diagnostique ou pronostique pouvant influencer le Tt Limites cellules tumorales trop peu nombreuses (pousse des cellules normales), ou non en cycle anomalies minimes anomalies génomiques et non chromosomiques, à rechercher en biologie moléculaire

33 Examens complémentaires en hématologie
Étude du réarrangement des gènes des immunoglobulines ou du récepteur T Le réarrangement des gènes des IG ou du TCR est spécifique de la cellule dans laquelle il se produit, donc de toute population tumorale (qui dérive par définition d’une seule cellule-mère) Extraction de l’ADN cellulaire, utilisation de sonde spécifique de JH pour les Ig, du segment J du TCR , par PCR le + souvent Indications Recherche d’une population monoclonale B ou T (pas d’approche de clonalité immunologique) - bilan initial - recherche de maladie résiduelle examen très spécialisé à discuter avec le biologiste Limites technique : absence de clone identifiable dans un lymphome malin Interprétation: Présence de clones contrôlés non malins chez sujets sains