Genre Brucella Bacilles Gram -, exigeants, AS, Oxydase +

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1 Genre Brucella Bacilles Gram -, exigeants, AS, Oxydase +
Civel / Joffin - Microbiologie ABM2

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3 L'île de Malte ayant une grande importance stratégique en Méditerranée, c'est l'Anglais Marston qui, en 1861, décrivit une maladie humaine fébrile à caractère ondulant qui y sévissait. En 1887, David Bruce isola du sang de la rate de malades décédés de brucellose un germe auquel il donna le nom de Micrococcus melitensis. En 1897, Wright constata une agglutination du germe par le sérum des malades, le séro-diagnostic de Wright pour la fièvre de Malte était donc l'homologue de celui de Widal pour la fièvre typhoïde. En 1905, Zamitt chercha, à Malte, à réaliser une étude expérimentale de la maladie. Comme les chèvres sont nombreuses dans l'île, il eut l'idée de les choisir comme animaux d'expérience. Mais, avant toute recherche, il importait de bien connaître leurs caractères sérologiques. C'est ainsi qu'il découvrit la positivité du séro-diagnostic de Wright chez toutes les chèvres, avant qu'aucune expérience ne fût commencée. Tel fut le début de l'étude de la maladie caprine; ses conditions de développement ne furent précisées qu'ensuite. La chèvre fait une maladie qui reste occulte, jusqu'à ce qu'elle soit conduite au bouc; elle ne porte pas jusqu'à terme: l'avortement est le premier symptôme apparent de l'infection, caractérisée en outre par la présence du germe dans l'utérus, les selles, les urines. L'animal se remet, mais reste porteur de germes; ceux-ci sont éliminés par le lait; ils peuvent d'autre part déterminer des mammites, une atteinte latente du foie et des ganglions. Lors d'une nouvelle mise bas, qui se termine bien ou mal, ils réapparaissent dans le lait. Ainsi, d'abord observée à Malte, la maladie, retrouvée sur toutes les côtes de la Méditerranée où foisonnent les troupeaux de chèvres, reçut le nom de fièvre ondulante méditerranéenne. Les Brucella sont responsables de maladies animales (zoonoses) en particulier la fièvre de Malte ou fièvre méditerranéenne. C'est Sir David Bruce qui a isolé en 1887 de la rate d'un homme décédé de cette maladie la bactérie Brucella melitensis (appelée alors Micrococcus). 10 ans plus tard Wright découvre l'agglutination des Brucella par le sérum des animaux malades. En 1895, Bang, vétérinaire danois, isole B. abortus de produits d'avortements bovins. EN 1914, Traum isole, aux USA, Brucella de produits d'avortements porcins.

4 1887, David Bruce isole un germe : Micrococcus melitensis,
Historique (résumé) Ile de Malte, l'Anglais Marston, en 1861, décrit une maladie humaine fébrile. 1887, David Bruce isole un germe : Micrococcus melitensis, = Brucella melitensis. 1897, Wright constate agglutination du germe par le sérum des malades : le séro-diagnostic de Wright. 1905, Zamitt découvre la positivité du séro-diagnostic de Wright chez toutes les chèvres de l’île de Malte.

5 1887, David Bruce isole = Brucella melitensis.
Historique Ile de Malte, l'Anglais Marston, en 1861, décrit une maladie humaine fébrile. 1887, David Bruce isole = Brucella melitensis. 1897, Wright constate le séro-diagnostic de Wright. 1905, Zamitt découvrit la positivité du séro-diagnostic de Wright chez toutes les chèvres de l’île de Malte. Avortement / MST L'animal se remet, mais reste porteur de germes La maladie est retrouvée sur toutes les côtes de la Méditerranée (troupeaux de chèvres) : fièvre de Malte.

6 - Très petits bacilles Gram négatif,
1. Définition phénotypique / Morphologie / Classification 1.1. phénotypie - Très petits bacilles Gram négatif, - Exigeants, mais forts résistants dans le milieu extérieur, - AS, - Oxydase +, Catalase + (en général), - Immobiles,

7 - Très petits bacilles Gram négatif,
1. Définition phénotypique / Morphologie - Très petits bacilles Gram négatif, - Exigeants, mais forts résistants dans le milieu extérieur, - AS, - Oxydase +, Catalase + (en général), - Immobiles, Uréase (rapide/constitutive) +, pour les souches pathogènes en général, - Glucides – (sur HL ou CTA) : en fait voie uniquement oxydative (et faible) MEVAG

8 Le génome est curieusement formé de 2 ADN circulaires (2,1 et 1,2 Mb).
1. Définition phénotypique / Morphologie / Classification 1.2. génome Le génome est curieusement formé de 2 ADN circulaires (2,1 et 1,2 Mb). Pas de plasmides. 1.3. Antigènes Leurs Antigènes de type O sont du LPS. Ils possédent des épitopes communs avec les bacilles Gram négatifs, par exemple avec Yersinia enterocolitica O9, Vibrio cholerae, Francisella tularensis, etc. Cet épitope est constitué de 100 résidus de 4-formamido-4,6-didéoxy-D-mannopyranoside Et les antigènes H sont ………

9 Ce genre comprend plusieurs espèces :
1. Définition phénotypique / Morphologie / Classification 1.4. Classification Groupe alpha-Proteobacteria / famille des Brucellaceae : genre Brucella,… Ce genre comprend plusieurs espèces : Pathogènes possible pour l’homme : B. melitensis (transmise par caprins et ovins), B. abortus (bovins), B. suis (porcins) … L'homogénéité génétique des Brucella est grande : On peut donc considérer qu'il n'y a qu'une seule espèce (melitensis) avec des sous-espèces. B. melitensis melitensis, B. melitensis abortus, B. melitensis suis.

10 Survie possible dans le milieu extérieur
3. Habitat et Pouvoir pathogène Survie possible dans le milieu extérieur Pathogènes intracellulaires facultatif 3.1. La ZOONOSE Zoonose : Brucella infecte de très nombreuses espèces animales, animaux domestiques que les animaux sauvages, avec des croisements possibles : - Brucella abortus, infecte les bovins - Brucella melitensis infecte les caprins et les ovins - Brucella suis, infecte les porcins Le lièvre est un facteur de dissémination important.

11 - IST, sorte de gonococcie animale.
2. Habitat et Pouvoir pathogène Brucellose : - Elle provoque des atteintes génitales, pouvant provoquer des avortements chez les femelles (variations selon l’espèce animale) - IST, sorte de gonococcie animale. Souvent l’infection reste inapparente : réservoir animal et dissémination ! Maladie essentiellement animale, de répartition mondiale. La brucellose bovine, ovine et caprine semble éradiquée en France depuis 2003. Fœtus morts

12 2. Habitat et Pouvoir pathogène
B. suis : Prévalence chez les suidés domestiques et sauvages Brucellose: Prévalence chez les ruminants domestiques

13 2.2. La maladie chez l’homme
2. Habitat et Pouvoir pathogène 2.2. La maladie chez l’homme L'homme est un hôte accidentel La Brucella la plus fréquente est B. melitensis melitensis. Maladie professionnelle : agriculteurs, éleveurs, bergers, bouchers, vétérinaires, laborantins, personnels des abattoirs… Lors de contamination professionnelle, la proportion de femmes est de 15,2 % avec 50 % pour le personnel de laboratoire.

14 Il ne semble pas y avoir de contamination interhumaine.
2. Habitat et Pouvoir pathogène La porte d'entrée est soit cutanée, soit digestive Il ne semble pas y avoir de contamination interhumaine. La bactérie s'installe dans un foyer local puis gagne un ganglion lymphatique avant de disséminer. Elle est capable de se multiplier dans les phagocytes en inhibant la fusion lysosome-phagosome. Cycle intracellulaire

15 Formes intermédiaires :
2. Habitat et Pouvoir pathogène Forme aigüe  : asthénie + fièvre ondulante avec sueurs. Forme chronique  : Patraquerie brucellienne (asthénie au long cours) Atteintes ostéoarticulaires avec présence de foyers bactériens cachés du système immunitaire incapables de détruire tous les foyers (granulomes) Hypersensibilité retardée importante cause des troubles Formes intermédiaires  : Il existe parfois des foyers dans différentes localisations dont l’évolution est souvent mortelle (en particulier après des septicémies sans traitement). Aujourd’hui, en France, il s’agit surtout d’une maladie d’importation rarissime.

16 La manipulation est DANGEREUSE.
3. Identification au laboratoire La manipulation est DANGEREUSE. La Brucellose est une maladie professionnelle pour les laborantins. Les Brucella sont classés dans le groupe 3 pour une manipulation en conditions de sécurité importante : Laboratoires spécialisés NSB3

17 3.2. Caractères bactériologiques préliminaires
3. Identification au laboratoire 3.1. Les prélèvements Hémocultures, parfois des ponctions des os, liquide articulaire, ganglionnaires… 3.2. Caractères bactériologiques préliminaires - Bacilles Gram négatif (très petit : 1 x 0,5 µm) - Immobiles - Acidorésistance de la paroi : coloration de Stamp (Vétérinaire)

18 3. Identification au laboratoire
3.3. Isolement CONDITIONS CULTURALES - atmosphère : AS mais certaines souches exigent du CO2 (Pour B. abortus, par exemple). température : Incubation optimale à 34-35°C. durée : 3-4 jours à 14 jours … CONDITIONS DE MILIEU Besoin en facteurs de croissance, en particulier de thiamine, niacinamide, biotine, Besoin de peptones non inhibitrices ou de détoxifiant comme le SANG MILIEU GS frais de mouton additionnée de sérum et d’agents sélectifs : cycloheximide?, bacitracine, polymyxine B, natamycine, acide nalixique, nystatine, vancomycine… RÉSULTAT : Colonies de type S (ou R), non hémolytique.

19 3.4. Tests d’identification API20NE - oxydase + et catalase +.
3. Identification au laboratoire 3.4. Tests d’identification API20NE - oxydase + et catalase +. - VF : Aérobies strictes. - NO3 + - Uréase + - Germe non fermentaire mais oxydatif (VP, LDC, ODC, ADH, Indole, lactose : tous négatif) / (Sur API20NE, l’identification peut être fausse : Moraxella phenylpyruvica).

20 3.4. Tests d’identification : les Epreuves de Huddleson :
3. Identification au laboratoire 3.4. Tests d’identification : les Epreuves de Huddleson :

21 3.4. Galerie d’identification
3. Identification au laboratoire 3.4. Galerie d’identification On peut aussi ajouter la recherche de sensibilité (tétracycline, rifampicine),

22 3.5. Identification immunologique
3. Identification au laboratoire 3.5. Identification immunologique - Agglutination sur sérum monospécifiques anti B. melitensis abortus, B. melitensis melitensis, B. melitensis suis. Recherche de l’antigène A et/ou M

23 3. Identification au laboratoire
3.6. Diagnostic génétique Amplification du gène codant pour l’ARN ribosomial 16S, puis séquençage : Brucella melitensis. Pour distinguer les sous-espèces, il faut étudier les profils de restriction du génome bactérien, ou étudier certains gènes par amplification/hybridation…

24 Le diagnostic peut être indirect par la mise en évidence d’Ac :
4. Diagnostic indirect immunologique au laboratoire Le diagnostic peut être indirect par la mise en évidence d’Ac : sérodiagnostic de Wright, agglutination en tubes qui doit être complété par la détection d'éventuels anticorps bloquants (Voir TP). immunofluorescence indirecte immunoenzymologie

25 4.1. Évolution des Ac dans le temps
4. Diagnostic indirect immunologique au laboratoire 4.1. Évolution des Ac dans le temps

26 4.2. Le sérodiagnostic de Wright

27 Le sérodiagnostic de Wright
Ce test quantitatif se positive précocement, dès le 10ème ou 12ème jour, IgM Une suspension de Brucella tuées Le sérodiagnostic de Wright

28 Le sérodiagnostic de Wright
Lecture du témoin : absence d’agglutination Attention aux phénomènes de Zone et aux anticorps bloquants… Un témoin positif doit aussi être ajouté. Le sérodiagnostic de Wright

29 Phénomène de Zone possible pour les faibles dilutions
Exemple d'un phénomène de zone avec un titre positif au 1/160e

30 Exemple : Titre = 80 Une sérologie positive doit tenir de l'éventuelle manque de spécificité. Il faut rechercher une éventuelle infection à Y. enterocolitica 09, une tularémie, ou encore une éventuelle vaccination à V. cholerae ....

31 Lors de négativité des tubes, il faut rechercher la présence d'anticorps bloquants (ne permettant pas la formation de réseau) en ajoutant une goutte d'immunsérum anti-Brucella après 24 h d'incubation à 37°C pour les trois premières dilutions. Une seconde lecture est effectuée après une nouvelle incubation de 24 h à 37°C. L'éclaircissement des tubes (ci-dessous) correspond à une réponse négative car les anticorps ajoutés ont agglutiné les antigènes non bloqués par les Ac bloquants.

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33 L'antibiogramme est délicat : culture lente et difficile.
5. Traitement et Antibiogramme L'antibiogramme est délicat : culture lente et difficile. On doit utiliser des antibiotiques à diffusion intracellulaire (tétracyclines et rifampicine, souvent en association avec la streptomycine, le chloramphénicol…) Brucellose chronique : traitement par antigénothérapie (désensibilisation).

34 ALIMENTS : Pasteurisation du lait
6. Prophylaxie CHEZ L’ANIMAL Surveillance régulière des troupeaux par détection des anticorps (sérologie) en particulier dans le lait (ring test) : les animaux malades sont abattus, et, en cas d'infection massive, le troupeau entier. La vaccination animale est possible mais empêcherait la surveillance. Elel est donc interdite en France CHEZ L’HOMME ALIMENTS : Pasteurisation du lait VÉTÉRINAIRE, ÉLEVEUR : port de gants, au contact des animaux suspects. LABORATOIRE : NSB3… et précautions habituelles (pas de contact direct avec les produits pathologiques et les cultures, en particuleir les hémocultures, désinfection immédiate en cas de problème et traçabilité de l’incident… Les vaccins tués sont utilisables chez l'homme.