Les Bacillus.

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1 Les Bacillus

2 Aspect microscopique Bacilles Gram + présentant une spore
À l’EF : mobiles le plus souvent par ciliature péritriche Distinction de trois groupes: Bacillus à spore ovale non déformante, Bacillus à spore ovale déformante, Bacillus à spore ronde déformante

3 Observation au MEB Forme végétative : bacilles à bouts arrondis Forme de résistance : spore dans un environnement favorable permet le développement d’un nouveau Bacillus.

4 Bacillus anthracis Observation microscopique
Grand bacille (5 µm de long, 1 µm de large), Gram +, Formant une spore ovalaire centrale non déformante. immobiles capsulé Caractères biochimiques: AAF, glucose +, non exigeant, VP + (caractère de la classification des Bacillus), gélatinase +, uréase -, maltose +, saccharose + Il élabore une toxine comprenant trois facteurs agissant en synergie: facteur I  oedématogène facteur II  immunogène facteur III létal

5 Les milieux de culture des Bacillus
Gélose à l’amidon Gélose nutritive à 1% d’amidon de riz ou de pomme de terre Ensemencer par une strie centrale à partir d’une suspension bactérienne. Ou en faisant 5 ou 6 dépôts d’öse sur la gélose Incuber 24 heures à 37°C

6 Gélose à l’oeuf Gélose trypticase-soja à 10% de jaune d’œuf stérile
Ensemencer par une strie centrale à partir d’une suspension bactérienne. Ou en faisant 5 ou 6 dépôts d’öse sur la gélose Incuber 24 heures à 37°C

7 Milieu TCA Composition pH = 6,8 à 7 Ensemencement
Source N Composition Peptone trypsique de caséine 20 g Chlorure de sodium 5 g Sulfite de sodium 0,5 g Cystine 0,5 g Rouge de phénol 0,017 g Gélose 2,5 g ED qsp 1 L Sources minérales Source de C et N Indicateur de pH pH = 6,8 à 7 Ensemencement Régénérer les milieux 20 min au BM à 100°C. Refroidir les tubes à 45°C. Incorporer le sucre désiré pour une concentration finale de 1% (10g.L-1). Solidifier les milieux sous l’eau froide. Ensemencer par piqûre centrale. Incuber 24 heures à 37°C.

8 Milieu de Mossel Composition pH = 7,1 Ensemencement
Source N Extrait de viande g Peptone g Mannitol g Chlorure de sodium g Rouge de phénol 0,025 g Agar g ED qsp 1 L Sources de carbone Sources minérales Indicateur de pH pH = 7,1 Au moment de l’emploi, ajouter à 90 mL de milieu: 10 mL de jaune d’œuf dilué au ½ dans de l’eau physiologique 1, 2, 5 ou 10 mL de polymyxine à 1 mg/mL (Inhibiteur) C’est un milieu d’isolement sélectif des Bacillus de l’espèce Bacillus cereus à partir des aliments ou des selles. Ensemencement Isolement par la technique des quadrants.

9 Gélose au lait Gélose blanche à 2,5 à 3% d’agar en solution dans l’eau dans laquelle on ajoute la même quantité de lait stérile. Ensemencer en faisant 5 ou 6 dépôts d’öse sur la gélose Incuber 24 heures à 37°C

10 Lecture des milieux Gélose à l’amidon Gélose à l’œuf
Recouvrir de lugol la gélose après culture Pas de coloration noire autour des cultures: absence d’amidon  il a été hydrolysé par les bactéries, test positif Coloration noire autour des cultures: présence d’amidon  test négatif Lecture directe: Éclaircissement du milieu de culture  les bactéries ont hydrolysé les lécithines du jaune d’œuf , test positif Gélose à l’œuf Pas de changement du milieu  test négatif

11 Gélose Mossel Colonies rouges entourées d’un halo opaque et blanchâtre  suspicion de Bacillus cereus, LECITHINASE +++ Colonies rouges  pas d’utilisation de mannitol par les bactéries  MANNITOL - Présence d’un halo: hydrolyse des lécithines par une lécithinase, en choline soluble et diglycéride insoluble qui précipite dans le milieu en formant un trouble.

12 Gélose au lait Lecture directe après culture
Halo clair autour de la culture  hydrolyse de la caséine, test positif Pas de modification du milieu autour de la culture  test négatif, la caséine n’est pas hydrolysée.

13 Correction du TP 1er jour N° impair: Bacilles en chaînette Gram +
N° pair: Bacilles en chaînette Gram + présence d’une spore déformante dans le bacille.

14 2nd jour N° pair: présence d’une spore centrale ovoïde déformante
Coloration des spores au vert de Malachite

15 Lecture du VF N° impair: culture en surface  AS 1ère orientation: bacilles Gram +, mobiles, catalase +, VP+, non exigeants,(sporogène), AS  orientation vers le genre Bacillus. N° pair: culture dans tout le tube  AAF 1ère orientation: Bacilles Gram +, mobiles, VP+, non exigeants, sporogènes, AAF  orientation vers le genre Bacillus.

16 Lecture des milieux CTA
N° impair glucose xylose arabinose Virage de l’indicateur de pH  glucose + Virage de l’indicateur de pH  xylose + Virage de l’indicateur de pH  arabinose +

17 N° pair glucose xylose arabinose Virage de l’indicateur de pH  glucose + Pas de virage de l’indicateur de pH  xylose - Pas de virage de l’indicateur de pH  arabinose -

18 Lecture de la gélose à l’amidon (n°pair et impair)
Pas de coloration autour de la culture  absence d’amidon qui a été hydrolysée par l’-amylase des Bacillus. Lecture de la gélose au lait (n°pair et impair) Présence d’un halo d’éclaircissement autour de la culture  de la caséine a été hydrolysée par les protéases des Bacillus.

19 Lecture de la gélose à l’œuf
n° pair Présence d’un halo clair autour de la culture  les lécithines ont été hydrolysées par la lécithinase des Bacillus. n° impair Pas de modification autour de la culture  les lécithines n’ont pas été hydrolysées.

20 Lecture de la gélose de Mossel
n° pair Colonie rose  pas d’utilisation du mannitol par les Bacillus  MANNITOL - Présence d’un halo clair autour de la culture  les protéines du jaune d’oeuf ont été hydrolysées par les protéases des Bacillus. Présence d’un halo opaque autour de la culture  les lécithines ont été hydrolysées par la lécithinase des Bacillus. Suspicion de Bacillus cereus Identification de l’espèce: Bacillus présentant divers enzymes (-amylase, lécithinase, protéases), glc +, xylose-, arabinose -, culture caractéristique sur Mossel  Bacillus cereus.

21 Lecture de la gélose de Mossel
n° impair Colonie jaune  Utilisation du mannitol par les Bacillus  MANNITOL + Absence d’un halo opaque autour de la culture  les lécithines n’ont pas été hydrolysées par les Bacillus. Il s’agit d’un Bacillus autre que Bacillus cereus Identification de l’espèce: Bacillus présentant divers enzymes (-amylase, protéases), glc +, xylose+, arabinose + Bacillus subtilis (tableau p 132 du livre).