Lundi 10 décembre 2007 ADN et chromosome Le nucléosome.

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1 Lundi 10 décembre 2007 ADN et chromosome Le nucléosome

2 Dimethylated Lys 9 of Histone H3 is shown in green, the Swi/Snf core ATPase Brg1 in red, and DNA in blue. The image was obtained using a Nikon Microphot FX fluorescence microscope. Scale bar represnts 3 µm. The winner would like to acknowledge the support of his advisor, Erik Knudsen, and technical assistance from Nancy Kleene (both at the University of Cincinnati College of Medicine, USA). Domaines hétérochromatiques dans un noyau de souris 3 m Solomon,D 2004, Nat cell Biol : Heterochromatic domains in a mouse nucleus

3 Plan I - Structure et fonction de l'ADN
II - ADN chromosomique et emballage dans la fibre chromatinienne organisation des gènes le long de la molécule d'ADN III - Structure globale des chromosomes emballage de la molécule d'ADN dans les chromosomes

4 III - Structure globale des chromosomes
Chromosomes en écouvillon Chromosomes polytènes de la drosophile Hétérochromatine / Euchromatine a – État de la chromatine  expression des gènes b – Télomères c – Centromères d - Défense contre les éléments mobiles d'ADN Chromosomes mitotiques Organisation des chromosomes dans le noyau interphasique

5 Structure globale des chromosomes (Rappel)
I - ADN II - Nucléosomes  30nm (0,1 cm de long) III - 30nm  organisation supérieure même en interphase Mal compris : boucles, enroulements

6 1 - Chromosomes en écouvillon
Dans une cellule en interphase, on ne voit pas les chromosomes (trop petits et trop emmêlés) MAIS il y a quelques exceptions où on voit l'organisation supérieure des chromomes ET on pense que certaines caractéristiques sont représentatives pour tous les chromosomes Un exemple : les chromosomes appariés de l'ovocyte d'amphibien très actifs en transcription forment des boucles de chromatine rigides et déroulées  le nom de chromosome en écouvillon visibles en microscopie optique

7 Chromosome en écouvillon (4 molécules d'ADN par chromosome) Microscopie optique
Lundi 10 décembre 2007 Fig 4-36(A) 0,1 mm

8 Lundi 10 décembre 2007 Microscopie optique à fluorescence AC contre les protéines de maturation de l'ARN La plupart des gènes portés par la boucle d'ADN est en cours d'expression Fig 4-36(B) 20 m

9 Fig 4-37 Structure du chromosome en écouvillon
Lundi 10 décembre 2007 Structure du chromosome en écouvillon Environ boucles au total La plupart de l'ADN est condensé en chromomère Chaque boucle correspond à une séquence d'ADN spécifique 4 copies de chaque boucle (diplotène) Fig 4-37

10 Chromosomes en écouvillon : illustration du phénomène suivant
La chromatine dont l'ADN est utilisé est décondensée La chromatine dont l'ADN n'est pas utilisé est condensée

11 Applications du modèle chromosomes en écouvillon
Dans les chromosomes en écouvillons correspondance précise Mais rarement observé dans les autres espèces

12 Applications du modèle chromosomes en écouvillon
De l'ADN de poisson (sans chromosomes en écouvillons) prend la forme de chromosomes en écouvillon quand on l'injecte dans l'ovocyte d'amphibien  hypothèse : Les chromosomes en interphase de tous les eucaryotes sont organisés en boucles trop petites et trop fragiles pour être observables

13 Applications du modèle chromosomes en écouvillon
Modèle d'étude pour l'ADN de mammifère qu'on injecte dans un ovocyte d'amphibien Corrélation boucle gène séquence d'ADN

14 2 - Chromosomes polytènes de la drosophile
Autre exemple de chromosome interphasique visible au microscope optique Plusieurs milliers de molécules d'ADN par chromosome = chromosome polytène chromosome polytène = 1 chromosome avec beaucoup de molécules d'ADN Cellule polyploïde = plusieurs lots de chromosomes avec chacun une molécule d'ADN

15 Chromosomes polytènes de la drosophile
Très étudié dans les cellules des glandes salivaires de larve de drosophiles 10 réplications sans séparation des 4 chromosomes  210 (= 1024) molécules d'ADN par chromosome

16 Lot complet de chromosomes polytènes dans une cellule de glande salivaire de drosophile
4 paires de chromosomes différents (2n = 8) Chaque paire est appariée  chaque paire apparaît comme une seule structure Lundi 10 décembre 2007 Fig 4-38

17 Fig 4-39 Microscopie optique d'une portion de chromosome polytène
Lundi 10 décembre 2007 Microscopie optique d'une portion de chromosome polytène Alternance de bandes sombres (95% de l'ADN) et d'interbandes claires (5% de l'ADN) Une bande ou interbande = 1024 séquences d'ADN alignées en phase Une bande = à paires de nucléotides Chaque bande est reconnaissable et numérotée Environ bandes et interbandes Fig 4-39 10m

18 Fig 4-40 Microscopie électronique de chromosome polytène
Lundi 10 décembre 2007 Chromatine plus condensée ou contient plus de protéines ou les deux Chromatine moins condensée Fig 4-40

19 Signification des bandes et des interbandes
Toujours pas de réponse claire depuis 1930 On a pensé que (faux) nombre de bandes  nombre de gènes  une bande  un gène En fait c'est faux et Nombre de gènes  3 X nombre de bandes On trouve des gènes dans des bandes et interbandes Certaines bandes ont plusieurs gènes Certaines bandes n'ont pas de gènes

20 Signification des bandes et des interbandes actuellement
Bande / Interbande est le reflet de différents niveaux d'expression génique Interbandes chromatine moins compacte gènes plus exprimés Bandes chromatine plus compacte gènes moins exprimés Le chromosome polytène est le reflet de la nature hétérogène de la compaction de la chromatine de tous les chromosomes interphasiques

21 Taux montent et descendent en fonction du dévelopement larvaire
Ecdysone Hormone stéroïde qui contrôle l'expression des gènes des chromosomes polytènes de la drosophile Taux montent et descendent en fonction du dévelopement larvaire si le taux monte les gènes codant pour les protéines s'expriment

22 Boursouflures chromosomiques (= "puffs" = nodules)
Au fur et à mesure du dévelopement des boursouflures chromosomiques apparaissent puis disparaissent quand de nouveaux gènes s'expriment ou s'éteignent Un puff  décondensation d'une bande

23 Lundi 10 décembre 2007 Renflements chromosomiques (bras gauche du chromosome 3) : apparition et disparition des renflements chromosomiques le long du chromosome polytène Chacun des 5 "puff" n'est actif que pendant une courte période Fig 4-41 22 heures

24 Anneaux de Balbiani "Puff" particulièrement grand d'un chromosome polytène Arrangement de la chromatine en boucles (comme dans les chromosomes en écouvillon) Visibles en microscopie électronique Surtout (≈que) dans les cellules des glandes salivaires du moucheron Chironomus tentans Chaque boucle contient un gène unique

25 Synthèse d'ARN dans un "puff" chromosomique (Chironomus tentans) AC anti BrU
Lundi 10 décembre 2007 Nouvel ARN à partir d'un anneau de Balbiani ARN synthétisés avant l'addition du BrUTP ayant diffusé de l'anneau de Balbiani ARN synthétisés à partir d'un l'anneau de Balbiani avant l'addition du BrUTP Fig 4-42(A)

26 Lundi 10 décembre 2007 Un "puff" d'un chromosome polytène Fig 4-42(B)

27 Fig 4-43(gauche) Chromosome polytène de Chironomus tentans
Lundi 10 décembre 2007 Fig 4-43(gauche) Chromosome polytène de Chironomus tentans Coupe dans un anneau de Balbiani (l'ensemble est un "puff")

28 Daneholt,B2001p7012 Salivary gland cells in the larvae of the dipteran Chironomus tentans offer unique possibilities to visualize the assembly and nucleocytoplasmic transport of a specific transcription product. Each nucleus harbors four giant polytene chromosomes, whose transcription sites are expanded, or puffed. On chromosome IV, there are two puffs of exceptional size, Balbiani ring (BR) 1 and BR 2. A BR gene is 35–40 kb, contains four short introns, and encodes a 1-MDa salivary polypeptide. The BR transcript is packed with proteins into a ribonucleoprotein (RNP) fibril that is folded into a compact ring-like structure. The completed RNP particle is released into the nucleoplasm and transported to the nuclear pore, where the RNP fibril is gradually unfolded and passes through the pore. On the cytoplasmic side, the exiting extended RNP fibril becomes engaged in protein synthesis and the ensuing polysome is anchored to the endoplasmic reticulum. Several of the BR particle proteins have been characterized, and their fate during the assembly and transport of the BR particle has been elucidated. The proteins studied are all added cotranscriptionally to the pre-mRNA molecule. The various proteins behave differently during RNA transport, and the flow pattern of each protein is related to the particular function of the protein. Because the cotranscriptional assembly of the pre-mRNP particle involves proteins functioning in the nucleus as well as proteins functioning in the cytoplasm, it is concluded that the fate of the mRNA molecule is determined to a considerable extent already at the gene level.

29 Daneholt,B2001p7012(fig1) Electron micrograph showing chromosome IV with its three giant puffs (Balbiani Rings) in a salivary gland cell from C. tentans. The three BRs (BR1, BR2, and BR3) are indicated as well as the nucleoplasm (Npl) and cytoplasm (Cpl). The arrows mark a few prominent transcription loops (cf. Fig. 2D). (Bar equals 2 μm.) Electron micrograph showing chromosome IV with its three giant puffs (Balbiani Rings) in a salivary gland cell from C. tentans. The three BRs (BR1, BR2, and BR3) are indicated as well as the nucleoplasm (Npl) and cytoplasm (Cpl).

30 Intracellular distribution of the cap-binding protein CBP20 in C
Intracellular distribution of the cap-binding protein CBP20 in C. tentans salivary gland cells studied by immunoelectron microscopy. The assembly of the BR RNP particle is shown in A– D: proximal portions of the BR gene are displayed in A, distal portions in B and C, and a schematic drawing of the BR gene in D (p, proximal; m, middle; d, distal portions of the gene). The fate of the released BR particles is shown in E–H: BR particles are present in the nucleoplasm (E), at the pore (F), and in an unfolded conformation when passing through the pore (G and H). Gold particles are marked by arrows and indicate the position of CBP20. It should be noted that gold particles are at the leading 5′ end of the BR particle when it passes through the nuclear pore. (Bar equals 100 nm.) Lundi 10 décembre 2007 Daneholt,B2001p7012(fig2) Intracellular distribution of the cap-binding protein CBP20 in C. tentans salivary gland cells studied by immunoelectron microscopy. The assembly of the BR RNP particle is shown in A–D: proximal portions of the BR gene are displayed in A, distal portions in B and C, and a schematic drawing of the BR gene in D (p, proximal; m, middle; d, distal portions of the gene). The fate of the released BR particles is shown in E–H: BR particles are present in the nucleoplasm (E), at the pore (F), and in an unfolded conformation when passing through the pore (G and H). Gold particles are marked by arrows and indicate the position of CBP20. It should be noted that gold particles are at the leading 5′ end of the BR particle when it passes through the nuclear pore. (Bar equals 100 nm.)

31 Daneholt,B2001p7012(fig3) BR RNA-associated proteins
Assembly and transport of the BR RNP particle and its relation to a number of BR RNA-associated proteins. The BR particle is assembled on the gene (left), passes through the nucleoplasm, unfolds, and translocates through the nuclear pore (middle). On the cytoplasmic side, the BR RNP fibril becomes engaged in protein synthesis and the polysomes anchor at the endoplasmic reticulum (right). The tripartite nuclear pore complex with its central channel is seen in black and its nuclear and cytoplasmic fibers are presented in pink. The BR gene with its five exons is displayed above the BR particle scheme, and the flow patterns of the BR RNA-associated proteins are outlined below. snRNP, small nuclear RNP. Lundi 10 décembre 2007 Daneholt,B2001p7012(fig3) 1, 2, 3, 4, 5 : exons Assembly and transport of the BR RNP particle and its relation to a number of BR RNA- associated proteins. The BR particle is assembled on the gene (left), passes through the nucleoplasm, unfolds, and translocates through the nuclear pore (middle). On the cytoplasmic side, the BR RNP fibril becomes engaged in protein synthesis and the polysomes anchor at the endoplasmic reticulum (right). The tripartite nuclear pore complex with its central channel is seen in black and its nuclear and cytoplasmic fibers are presented in pink. The BR gene with its five exons is displayed above the BR particle scheme, and the flow patterns of the BR RNA-associated proteins are outlined below. snRNP, small nuclear RNP. BR RNA-associated proteins

32 Fig 4-42(droite) Boucle de chromatine dans un anneau de Balbiani
Lundi 10 décembre 2007 Boucle de chromatine dans un anneau de Balbiani Fig 4-42(droite)

33 Conclusions sur les anneaux de Balbiani
Lundi 10 décembre 2007 Conclusions sur les anneaux de Balbiani Quand le gène s'exprime, la fibre de chromatine de 30 nm se décondense mais garde ses 4 histones Par défaut la fibre est sous la forme 30 nm Peuvent décondenser cette fibre : les modifications des histones les complexes de remodelage de la chromatine les protéines de régulation de l'expression des gènes La boucle serait un domaine fonctionnel indépendant #4p222

34 Lundi 10 décembre 2007 Extrapolation Tout l'ADN des chromosomes polythènes est organisé en boucles qui se condensent et se décondensent Tous les chromosomes interphasiques de tous les eucaryotes sont emballés en boucles contenant quelques gènes dont l'expression est régulée de façon coordonnée #4p222

35 Fig 4-44 Modèle de structure du chromosome interphasique
Lundi 10 décembre 2007 à paires de nucléotides Modèle de structure du chromosome interphasique Déduit à partir de quelques cas rares Fig 4-44 #4p222

36 3 - Hétérochromatine / Euchromatine
Lundi 10 décembre 2007 3 - Hétérochromatine / Euchromatine État de la chromatine  expression des gènes Télomères Centromères Défense contre les éléments mobiles d'ADN #5p222

37 Historique (1938) Deux types de chromatine en interphase (MO)
Hétérochromatine : toujours condensée (même en interphase) Euchromatine : le reste

38 Actuellement Euchromatine ( fibre de 30 nm et boucles)
Hétérochromatine contient des protéines supplémentaires Plus compacte  10 % du génome est hétérochromatique Régions spécifiques : centromères et télomères

39 Hétérochromatine Son ADN ne contient presque pas de gènes
Les gènes emballés dans de l’hétérochromatine ne peuvent pas s’exprimer Fonctionnement des télomères et centromères Certains gènes ont même besoin d’être localisés dans de l’hétérochromatine pour s’exprimer Le mot hétérochromatine comprend plusieurs types de structure de chromatine avec un très haut degré d’organisation L’hétérochromatine n’est pas un emballage d’ADN "mort"

40 a - Expression de l'hétérochromatine
Un gène qui s'exprime dans de l'euchromatine ne s'exprime plus s'il est localisé dans de l’hétérochromatine : il devient "silencieux"  exemple d'effet de position Effet de position : l'activité d'un gène dépend de sa position le long du chromosome

41 Effet de position Découvert chez la drosophile
= influence de l'état de la chromatine le long du chromosome sur l'expression du gène  Chromosome = mosaïque de formes différentes de chromatine dont chacune a un effet particulier sur la capacité de l'ADN à être sous le contrôle de la cellule

42 Deux exemples de diversification par effet de position
1 - Gène ADE2 de la levure 2 - Gène white de la drosophile

43 Exemples de diversification par effet de position 1/2 : Gène ADE2 de la levure
Position normale  expression Position près du télomère (hétérochromatique)  pas d'expression ADE2 code pour une enzyme de la synthèse de l'adénine Si absence  accumulation de pigment rouge Parfois le gène redevient actif dans la descendance : emballage moins serré de l'hétérochromatine

44 Exemples de diversification par effet de position : Gène ADE2 de la levure
Lundi 10 décembre 2007 Fig 4-45 (A) P222#5

45 Exemples de diversification par effet de position 2/2 : Gène white de la drosophile
Le gène white contrôle la couleur des yeux Gène white normal (allèle sauvage white +  yeux rouges) Gène white muté (allèle muté white -  yeux blancs [d'où le nom]) Le gène white normal (white +) Position normale  expression  yeux rouges Position proche de hétérochromatine  pas d'expression  yeux blancs En fait mottes rouges et blanches : présence de rouge car pas d'inactivation pendant la période embryonnaire

46 Exemples de diversification par effet de position : Gène white de la drosophile
Lundi 10 décembre 2007 Fig 4-45 (B) P222#5

47 Deux exemples de diversification par effet de position : gène ADE2 de la levure et gène white de la drosophile Un gène peut se réactiver (colonies rouges et blanches, yeux avec mottes rouges et blanches) Une fois réactivé, transmission aux cellules filles Si emballé avec l'hétérochromatine, inactivation transmises aux cellules filles

48 Deux caractères de l'hétérochromatine
Dynamique Peut s'étendre puis se retirer État héritable d'une cellule à la fille Explique la "diversification par effet de position"

49 Lundi 10 décembre 2007 ADN limitant empêchant l'hétérochromatine de déborder sur l'euchromatine (peut disparaître au cours de remaniements) Fig 4-46(A)

50 Lundi 10 décembre 2007 Débordement variable de l'hétérochromatine au cours du développement hérité précocément  aspect "bariolé" (variegated) de ces mouches Fig 4-46(B)

51 b – Télomères p224#6 Le meilleur modèle : S. cerevisiae
Lundi 10 décembre 2007 b – Télomères Le meilleur modèle : S. cerevisiae Pas d'expression de gène à 5000 paires de nucléotides des extrémités des chromosomes : structure hétérochromatique Intervention d'enroulement et de protéines Beaucoup de ces protéines sont connues chez S. cerevisiae : Silent information regulator (protéines Sir) p224#6

52 Protéines Sir (Silent information regulator)
Lundi 10 décembre 2007 Protéines Sir (Silent information regulator) Des mutations dans les protéines Sir empêchent le silence des gènes proches des télomères Découverte d'un complexe de protéine Sir lié au télomère qui reconnaît les queues de certaines histones sous-acétylées p226#6

53 Lundi 10 décembre 2007 Hétérochromatine de l'extrémité des chromosomes de levure H4 H4 Fig 4-47(A) p226#6

54 Kimura,A2002p370 Nat Genet(fig5)
Lundi 10 décembre 2007 Kimura,A2002p370 Nat Genet(fig5) Model of the role of acetylation of H4–Lys16 in the localization of silencing proteins along chromosomes. a, Model of the region-dependent regulation of the interaction between Sir3p and H4 through the reversible acetylation of H4–Lys16 by Sas2p and Sir2p. b, Model of the function of the chromosomal gradient as a boundary to prevent the spread of silencing proteins. In the wildtype strain (top), the marked increase in the acetylation of H4–Lys16 from the end of the telomere to the telomere-proximal region acts as a steep ‘slope’ that Sir3p (green spheres) must overcome to diffuse throughout the chromosome. In the absence of Sas2p (middle), acetylation of H4–Lys16 in the telomere-proximal region is decreased, which allows Sir3p to diffuse. In the absence of Sir2p (bottom), deacetylation of H4–Lys16 at the ends of the telomere does not occur, and Sir3p is not retained in this region. Nat Genet 2002, vol. 32 no. 3 pp 370 - 377 (fig5) Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing, Kimura,A Fig. 5 Model of the role of acetylation of H4–Lys16 in the localization of silencing proteins along chromosomes. a, Model of the region-dependent regulation of the interaction between Sir3p and H4 through the reversible acetylation of H4–Lys16 by Sas2p and Sir2p. b, Model of the function of the chromosomal gradient as a boundary to prevent the spread of silencing proteins. In the wildtype strain (top), the marked increase in the acetylation of H4–Lys16 from the end of the telomere to the telomere-proximal region acts as a steep ‘slope’ that Sir3p (green spheres) must overcome to diffuse throughout the chromosome. In the absence of Sas2p (middle), acetylation of H4–Lys16 in the telomere-proximal region is decreased, which allows Sir3p to diffuse. In the absence of Sir2p (bottom), deacetylation of H4–Lys16 at the ends of the telomere does not occur, and Sir3p is not retained in this region.

55 Suka,N2002p378(fig6) Nat Genet 32,(3):Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin

56 Sir2 (Silent information regulator 2)
Lundi 10 décembre 2007 Sir2 (Silent information regulator 2) Désacétylase d'histone  sous acétylation d'histone propre à l'hétérochromatine  emballage plus serré des nucléosomes Très conservée p226#6

57 Protéines de liaison à l'ADN spécifiques  fixation d'une protéine Sir (Sir2?) le long du chromosome  désacétylation des queues d'histones (par Sir2)  création de nouveaux sites de fixation de Sir Lundi 10 décembre 2007 Fig 4-47(B) p226#6

58 Modèle hypothétique d'héritabilité de l'hétérochromatine
Lundi 10 décembre 2007 Fig 4-48(A) p226#6

59 Lundi 10 décembre 2007 Modèle hypothétique d'héritabilité de l'hétérochromatine Fig 4-48(B) p226#6

60 Rôle des histones méthyl transférases
Lundi 10 décembre 2007 Rôle des histones méthyl transférases Méthylent des lysines spécifiques (K9 de H3) Lue par les composants hétérochromatiques  Assemblage en hétérochromatine p226#6

61 Intérêt des télomères Protection des extrémités des chromosomes
Lundi 10 décembre 2007 Intérêt des télomères Protection des extrémités des chromosomes Régulation de la longueur des chromosomes Ségrégation des chromosomes pendant la mitose p226#6

62 Résumé Modifications covalentes des histones Transmises p226#6
Lundi 10 décembre 2007 Résumé Modifications covalentes des histones Transmises p226#6

63 Lundi 10 décembre 2007 c – Centromères Séquences d'ADN qui permettent la ségrégation des chromosomes Présence d’hétérochromatine autour des centromères Centromères inclus dans de grandes étendues d'hétérochromatine où les gènes ne s'expriment pas (si on en met) #7p226

64 Hétérochromatine centrique (centromérique)
Lundi 10 décembre 2007 Hétérochromatine centrique (centromérique) Histones Sous acétylées Méthylées Autres protéines Modèle d'étude : S. cerevisiae #7p227

65 Lundi 10 décembre 2007 S. Cerevisiae 125 paires de nucléotides sont suffisants pour former un centromère Plus une douzaine de protéines  Un nucléosome spécifique de centromère #7p227

66 Nucléosome de centromère chez S. cerevisiae
Lundi 10 décembre 2007 Nucléosome de centromère chez S. cerevisiae Variant de histone H3 (CENP-A) + H2A + H2B + H4 plus d'autres protéines Fig 4-49

67 Fig 4-49 Chromosomes mitotiques de Drosophile
Lundi 10 décembre 2007 Chromosomes mitotiques de Drosophile Histone H3 conventionnelle fusionnée avec GFP ( couleur verte de H3) En rouge composant du kinétochore coloré par un AC spécifique Fig 4-49

68 Fig 4-49 Chromosomes mitotiques de Drosophile
Lundi 10 décembre 2007 Chromosomes mitotiques de Drosophile Histone H3 spécifique du centromère fusionnée avec GFP ( couleur verte de H3) + En rouge composant du kinétochore coloré par un AC spécifique = Localisation des centromères en jaune Fig 4-49

69 Organismes complexes Drosophile, humain
Centaines de milliers de paires de nucléotides Pas de séquence d'ADN spécifique ADN  satellite (petites séquences d'ADN répétées)

70 Lundi 10 décembre 2007 Structure d'un centromère humain Fig 4-50

71 Séquences centromériques
Les mêmes séquences d'ADN  satellite placées sur d'autres chromosomes ne forment pas de centromères !!! De plus formation du kinétochore ??? Rôle des protéines > rôle de l'ADN ??? Formation et maintien de centromère  Formation et maintien de hétérochromatine

72 Aspect phylogénétique des centromères
Lundi 10 décembre 2007 Aspect phylogénétique des centromères Présence d'ADN  satellite non fonctionnel sur des chromosomes identique à l'ADN  satellite des centromères  Phénomène de fusion de chromosomes avec création d'un nouveau centromère qui devient inactif Possibilité de formation de néocentromères sans ADN  satellite #7p227

73 Lundi 10 décembre 2007 Phénomène de fusion de chromosomes avec création d'un nouveau centromère qui est devenu inactif Fig 4-51(AB) Chromosome surnuméraire qui se crée un centromère sur de l'ADN non  satellite

74 Lundi 10 décembre 2007 Modèle d'explication de la plasticité et de l'héritabilité des centromères Fig 4-51(C)

75 Plasticité des centromères
Lundi 10 décembre 2007 Plasticité des centromères Formation de complexes de protéines de liaison à l'ADN qui ont plus d'"appétit" pour l'ADN  satellite Cette marque pourrait se "perdre" (!!!) Avantage évolutif Évolution des chromosomes par cassure-recollement (cf. évolution) #7p229

76 d – Défense contre les éléments mobiles d'ADN
Lundi 10 décembre 2007 d – Défense contre les éléments mobiles d'ADN En résumé Hétérochromatine  courtes séquences répétées d'ADN en tandem (pas de codage de protéines) Euchromatine  riche en gènes à copie unique Mais Il y a des gènes dans l'hétérochromatine Il y a des séquences répétées dans l'euchromatine #8p229

77 Mutité génique induite par la répétition du gène
Lundi 10 décembre 2007 Mutité génique induite par la répétition du gène Si on introduit des séquences répétées de gènes dans le génome (souris ou drosophile)  Pas d'expression Formation d'hétérochromatine Si on introduit la séquence unique du même gène au même endroit  Expression du gène #8p229

78 Mutité génique induite par la répétition du gène
Lundi 10 décembre 2007 Mutité génique induite par la répétition du gène Mécanisme de protection contre l'invasion par les éléments génétiques mobiles Emballage en hétérochromatine et mutisation des éléments pour éviter leur prolifération Même mécanisme pour l'hétérochromatine juxta centromérique ? #8p229

79 4 - Chromosomes mitotiques
Lundi 10 décembre 2007 4 - Chromosomes mitotiques Stade ultime de condensation Seul moment où les chromosomes sont visibles (exception écouvillon, polythènes) Raccourcissement du chromosome interphasique de 10 fois P229#9

80 4 – Chromosomes mitotiques
a – Caryotype b – Emballage de la chromatine dans le chromosome mitotique

81 a – Caryotype

82 Chromosome mitotique typique: 2 chromatides contenant chacune une molécule d'ADN identique générée pendant la phase S du cycle cellulaire Lundi 10 décembre 2007 Fig 4-52 #9p229

83 Extrémité d'un chromosome mitotique vue en microscopie à balayage : nombreux domaines en boucle après extraction des complexes de riboprotéines Lundi 10 décembre 2007 Fig 4-53 #9p229

84 Fig 4-54 #9p229 Microscopie électronique d'un chromosome mitotique
Lundi 10 décembre 2007 Microscopie électronique d'un chromosome mitotique Les boucles émanent d'une charpente centrale Boucle  gène (très grossièrement) #9p229 Fig 4-54

85 Caryotype 46 chromosomes Marquage longitudinal
Lundi 10 décembre 2007 Caryotype 46 chromosomes Marquage longitudinal #10p230(a été volontairement déplacé)

86 Caryotype : bandes G #10p231(a été volontairement déplacé)
Lundi 10 décembre 2007 #10p231(a été volontairement déplacé)

87 Caryotype : bandes G #10p231(a été volontairement déplacé)
Lundi 10 décembre 2007 #10p231(a été volontairement déplacé)

88 Caryotype spectral #10p231(a été volontairement déplacé)
Lundi 10 décembre 2007 #10p231(a été volontairement déplacé)

89 Caryotype : un chromosome
Lundi 10 décembre 2007 Caryotype : un chromosome Bras (p ou q) Région (eg : p1) Bande (eg : p11) Sous-bande (eg : p11.2) Sous-sous-bande (eg : p11.23) #10p231(a été volontairement déplacé)

90 Bandes S'observent chez toutes les espèces : humain, drosophile…
Très conservées Homme  chimpanzé, gorille, orang-outan

91 Lundi 10 décembre 2007 Comparaison du plus grand chromosome humain (le 1) avec celui du chimpanzé,du gorille et de l'orang-outan  Les chromosomes sont organisés en très grands domaines importants pour leur fonction Fig 4-57

92 Corrélation bande du chromosome métaphasique  bande du chromosome polythène
Lundi 10 décembre 2007 Aucune relation Du début de la mitose à la fin les bandes sont De moins en moins nombreuses (elles fusionnent) De plus en plus épaisses #10p231(a été volontairement déplacé)

93 Corrélation bande du chromosome métaphasique  bande du chromosome polythène
Lundi 10 décembre 2007 La bande la plus fine du caryotype contient plus d'un million de paires de nucléotides (≈ un génome bactérien) Bandes plus ou moins riches en GC (ou AT)  à peu près aux bandes des chromosomes #10p231(a été volontairement déplacé)

94 Zones GC riches Bandes R Forte densité en gène Gènes domestiques
Lundi 10 décembre 2007 Zones GC riches Bandes R Forte densité en gène Gènes domestiques Empaquetage des boucles de chromatine Plus de molécules qui participent à l'expression des gènes #10p232 (a été volontairement déplacé)

95 Zones AT riches Bandes G #10p232 (a été volontairement déplacé)
Lundi 10 décembre 2007 Zones AT riches Bandes G #10p232 (a été volontairement déplacé)

96 b – Emballage de la chromatine dans le chromosome mitotique

97 Lundi 10 décembre 2007 Emballage de la chromatine Fig 4-55 #9p229

98 c - Condensation des chromosomes en mitose
Lundi 10 décembre 2007 c - Condensation des chromosomes en mitose Deux conséquences Individualisation des chromatides Protection des chromosomes Nécessité des condensines #9p230

99 Condensines (incluent les SMC)
Lundi 10 décembre 2007 Condensines (incluent les SMC) Utilisent de l'ATP Servent à l'enroulement du chromosome interphasique Gros complexes protéiques qui contiennent les protéines SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) #9p230

100 Protéines SMC (sont incluses dans les condensines)
Lundi 10 décembre 2007 Protéines SMC (sont incluses dans les condensines) Composants d'un complexe de condensine beaucoup plus gros Longues molécules dimériques avec une charnière centrale Domaine globulaire à chaque extrémité ADN + SMC + ATP  grandes boucles d'ADN + ADP Composant important des chromosomes mitotiques : une molécule tous les nucléotides #9p230

101 Lundi 10 décembre 2007 Protéine SMC Fig 4-56 #9p230

102 5 - Organisation des chromosomes dans le noyau interphasique
Lundi 10 décembre 2007 5 - Organisation des chromosomes dans le noyau interphasique Noyau différent d'un sac à chromosomes En interphase semble désordonné En mitose très orienté Centromère d'un côté Télomères de l'autre Dans certains noyaux persistance de cette disposition en interphase : orientation rabl #11p232

103 Fig 4-58 Racine de plante en interphase en fluo #11p232
Lundi 10 décembre 2007 Racine de plante en interphase en fluo Centromères en vert Télomères en rouge Fig 4-58 #11p232

104 Fig 4-59 #11p232 Polymère en solution Embryon de drosophile
Lundi 10 décembre 2007 Polymère en solution Embryon de drosophile Fig 4-59 #11p232

105 Embryon de drosophile Division cellulaire toutes les 10 minutes
Lundi 10 décembre 2007 Embryon de drosophile Division cellulaire toutes les 10 minutes Les chromosomes n'ont pas le temps de quitter l'orientation rabl Quand l'interphase est plus longue les chromosomes ont le temps de se replier Ce repliement est lié à des associations spécifiques à l'intérieur de différentes régions d'un même chromosome #11p232

106 Cellule "commune" Les centromères sont dispersés
Chaque chromosome semble avoir une position donnée et son petit territoire : tous les chromosomes ne sont pas emmêlés les uns dans les autres

107 Chromosome painting de deux chromosomes interphasiques de lymphocytes humains
Lundi 10 décembre 2007 Fig 4-60 #11p233 Les deux chromosomes 19 Les deux chromosomes 18

108 Lundi 10 décembre 2007 Human chromosomes 18 and 19 interphase territories. 2D preparations of nuclei, swollen in hypotonic and fixed either with MAA (a-d) or with 4% pFa (e), were hybridized with HSA18 and 19 paints. In the central panels of a-e HSA18 and 19 paints were biotinylated and detected with avidin-FITC (green). In the left-hand panels of a and b, paints were labeled either with biotin and detected with TR (red) or with digoxigenin and detected with FITC (green). All nuclei were counterstained with DAPI (blue). (a) Primary lymphocytes; (b and e) lymphoblastoid cell line; (c) primary fibroblasts; (d) HT1080 fibrosarcoma cells. Bars, 2 µm. On the right, histograms show the mean proportion of DAPI stain (blue bars), and HSA18 (filled bars) and HSA19 (open bars) hybridization signals in each of the five concentric shells of equal area eroded from the periphery (1) to the center (5) of 50 segmented nuclei. Error bars show SEM. Croft,A1999p1119(fig1) Fig. 1.   Human chromosomes 18 and 19 interphase territories. 2D preparations of nuclei, swollen in hypotonic and fixed either with MAA (a-d) or with 4% pFa (e), were hybridized with HSA18 and 19 paints. In the central panels of a-e HSA18 and 19 paints were biotinylated and detected with avidin-FITC (green). In the left-hand panels of a and b, paints were labeled either with biotin and detected with TR (red) or with digoxigenin and detected with FITC (green). All nuclei were counterstained with DAPI (blue). (a) Primary lymphocytes; (b and e) lymphoblastoid cell line; (c) primary fibroblasts; (d) HT1080 fibrosarcoma cells. Bars, 2 µm. On the right, histograms show the mean proportion of DAPI stain (blue bars), and HSA18 (filled bars) and HSA19 (open bars) hybridization signals in each of the five concentric shells of equal area eroded from the periphery (1) to the center (5) of 50 segmented nuclei. Error bars show SEM.

109 Lundi 10 décembre 2007 Croft,A1999p1119(fig2) Fig. 2.   Subnuclear localization of HSA18 and 19 in optical sections through 3D-preserved nuclei. Confocal z series (1 µm) of hybridization to 4% pFa-fixed 3D human dermal fibroblasts with paints for either HSA18 (a and b) or HSA19 (c and d), prepared from randomly amplified total DNA from each chromosome and detected with FITC (green-yellow) and counterstained with PI (red). Cells were either untreated (a and c) or treated with DRB (b and d). Bars, 10 µm. Fig. 2.   Subnuclear localization of HSA18 and 19 in optical sections through 3D-preserved nuclei. Confocal z series (1 µm) of hybridization to 4% pFa-fixed 3D human dermal fibroblasts with paints for either HSA18 (a and b) or HSA19 (c and d), prepared from randomly amplified total DNA from each chromosome and detected with FITC (green-yellow) and counterstained with PI (red). Cells were either untreated (a and c) or treated with DRB (b and d). Bars, 10 µm.

110 Lundi 10 décembre 2007 HSA18 and 19 territories through the cell cycle. (a) Combined FISH and immunofluorescence in 4% pFa-fixed 3D fibroblasts with either chromosome 18 or 19 paints (green) and with antibodies against pKi-67 (red) and B-type lamin (blue). The cells on the left are in early stages of G1 and those on the right in mid G1, S, or G2 based on their pattern of pKi-67 staining (Bridger et al., 1998 ). Bar, 5 µm. (b) FISH for HSA18 or 19 (red) in flattened preparations of MAA-fixed lymphoblast nuclei, pulsed with BrdU (green), and separated by centrifugal elutriation. Blue is DAPI. Bar, 2 µm. FACS® analyses of PI-stained nuclei from elutriated fractions chosen to represent G1, early S, late S, and G2 are shown beneath each panel. Horizontal bars on the FACS® profiles indicate the gating for cells in G1 (left) and for those in S and G2 (right). Croft,A1999p1119(fig3) Fig. 3.   HSA18 and 19 territories through the cell cycle. (a) Combined FISH and immunofluorescence in 4% pFa-fixed 3D fibroblasts with either chromosome 18 or 19 paints (green) and with antibodies against pKi-67 (red) and B-type lamin (blue). The cells on the left are in early stages of G1 and those on the right in mid G1, S, or G2 based on their pattern of pKi-67 staining (Bridger et al., 1998 ). Bar, 5 µm. (b) FISH for HSA18 or 19 (red) in flattened preparations of MAA-fixed lymphoblast nuclei, pulsed with BrdU (green), and separated by centrifugal elutriation. Blue is DAPI. Bar, 2 µm. FACS® analyses of PI-stained nuclei from elutriated fractions chosen to represent G1, early S, late S, and G2 are shown beneath each panel. Horizontal bars on the FACS® profiles indicate the gating for cells in G1 (left) and for those in S and G2 (right).

111 Dependence of territory sizes on transcription and histone deacetylation
(a) Frequency histograms of the proportion of nuclear area occupied by hybridization signals (detected with FITC) of HSA18 (filled bars) and 19 (open bars) in 50 swollen and flattened MAA-fixed lymphoblastoid nuclei. (b) Histograms of the proportion of summed nuclear area occupied by hybridization signals (detected with FITC) of HSA18 (filled bars) and 19 (open bars) through the confocal sections of 5-10 fibroblast nuclei fixed with 4% pFa. Vertical solid and dashed lines show mean proportionate areas for HSA18 and 19, respectively. Cells were either untreated, or treated with AMD, DRB, or TSA before harvest. DRB-treated cells were also grown for 1 h in the absence of DRB (DRB release). Lundi 10 décembre 2007 Croft,A1999p1119(fig4) Fig. 4.   Dependence of territory sizes on transcription and histone deacetylation. (a) Frequency histograms of the proportion of nuclear area occupied by hybridization signals (detected with FITC) of HSA18 (filled bars) and 19 (open bars) in 50 swollen and flattened MAA-fixed lymphoblastoid nuclei. (b) Histograms of the proportion of summed nuclear area occupied by hybridization signals (detected with FITC) of HSA18 (filled bars) and 19 (open bars) through the confocal sections of 5-10 fibroblast nuclei fixed with 4% pFa. Vertical solid and dashed lines show mean proportionate areas for HSA18 and 19, respectively. Cells were either untreated, or treated with AMD, DRB, or TSA before harvest. DRB-treated cells were also grown for 1 h in the absence of DRB (DRB release).

112 Lundi 10 décembre 2007 Fig. 5.   The orientation of chromosomes 18 and 19 in normal nuclei and those from a t(18;19). (a and b) Lymphoblast nuclei cohybridized with paints specific for 18p and q arms (Guan et al., 1996 ). 18p is in red in a and in green in b. 18q is in the reciprocal color in each case, as indicated. DAPI counterstain is blue. (c and d) Lymphoblast nuclei cohybridized with paints specific for 19p and q arms (Guan et al., 1996 ). 19p is in red in c and in green in d. 19q is in the reciprocal color in each case, as indicated. DAPI counterstain is blue. (e) Flattened primary lymphocytes hybridized simultaneously with HSA18 paint (red) and telomeric clones 52M11 and 75F20 (green) specific for 18pter and qter, respectively. DAPI counterstain is blue. (f) 3D-preserved nuclei cohybridized with HSA18 paint (green) and telomeric clones 52M11 and 75F20 (red). Red signal in the cytoplasm is from endogenous biotin. Telomere signals are apparent with only one of the territories, those associated with the other territory are in a different focal plane. (g) FISH to a metaphase spread from an individual with t(18; 19)(p11;p13) with chromosome 18 material shown in green and 19 in red. The appropriately colored arrows indicate the derived chromosomes. (h and i) Interphase nuclei from t(18;19) cells. HSA18-derived material is detected in green in h and in red in i. HSA19 is detected in the reciprocal color in each panel as indicated. As in g, appropriately colored arrows indicate the derived chromosomes. A line was drawn from the center to the edge of the nucleus passing through each derived chromosome. A second line, perpendicular to the first, was put through the middle of the signal and it was ascertained which side of this line the translocated portion was found. (j) Histograms of the position of the edge of the signal in relation to the edge or the center of the nucleus, in 50 t(18;19) nuclei, for both the normal (open bars) and derived (filled bars) chromosomes 18 and 19. There is no significant difference in the positions of derived and normal chromosomes (P < 0.059 for HSA18 and P < 0.110 for HSA19). Croft,A1999p1119(fig5) Fig. 5.   The orientation of chromosomes 18 and 19 in normal nuclei and those from a t(18;19). (a and b) Lymphoblast nuclei cohybridized with paints specific for 18p and q arms (Guan et al., 1996 ). 18p is in red in a and in green in b. 18q is in the reciprocal color in each case, as indicated. DAPI counterstain is blue. (c and d) Lymphoblast nuclei cohybridized with paints specific for 19p and q arms (Guan et al., 1996 ). 19p is in red in c and in green in d. 19q is in the reciprocal color in each case, as indicated. DAPI counterstain is blue. (e) Flattened primary lymphocytes hybridized simultaneously with HSA18 paint (red) and telomeric clones 52M11 and 75F20 (green) specific for 18pter and qter, respectively. DAPI counterstain is blue. (f) 3D-preserved nuclei cohybridized with HSA18 paint (green) and telomeric clones 52M11 and 75F20 (red). Red signal in the cytoplasm is from endogenous biotin. Telomere signals are apparent with only one of the territories, those associated with the other territory are in a different focal plane. (g) FISH to a metaphase spread from an individual with t(18; 19)(p11;p13) with chromosome 18 material shown in green and 19 in red. The appropriately colored arrows indicate the derived chromosomes. (h and i) Interphase nuclei from t(18;19) cells. HSA18-derived material is detected in green in h and in red in i. HSA19 is detected in the reciprocal color in each panel as indicated. As in g, appropriately colored arrows indicate the derived chromosomes. A line was drawn from the center to the edge of the nucleus passing through each derived chromosome. A second line, perpendicular to the first, was put through the middle of the signal and it was ascertained which side of this line the translocated portion was found. (j) Histograms of the position of the edge of the signal in relation to the edge or the center of the nucleus, in 50 t(18;19) nuclei, for both the normal (open bars) and derived (filled bars) chromosomes 18 and 19. There is no significant difference in the positions of derived and normal chromosomes (P < 0.059 for HSA18 and P < 0.110 for HSA19).

113 Associations of HSA18 and 19 with nuclear substructure
Associations of HSA18 and 19 with nuclear substructure. Lymphoblastoid nuclei extracted with 0.5, 1.0, 1.2, and 1.8 M NaCl, fixed with MAA, and hybridized with alternately labeled chromosome 18 and 19 paints, the color of which is indicated at the right of each panel. DNA was stained with DAPI (shown in blue on the right and in black and white on the left). Chromosome 19 material is retained within the residual nucleus. HSA18 is released into the DNA halo at high salt concentrations. Bar, 2 µm. Lundi 10 décembre 2007 Croft,A1999p1119(fig6) Fig. 6.   Associations of HSA18 and 19 with nuclear substructure. Lymphoblastoid nuclei extracted with 0.5, 1.0, 1.2, and 1.8 M NaCl, fixed with MAA, and hybridized with alternately labeled chromosome 18 and 19 paints, the color of which is indicated at the right of each panel. DNA was stained with DAPI (shown in blue on the right and in black and white on the left). Chromosome 19 material is retained within the residual nucleus. HSA18 is released into the DNA halo at high salt concentrations. Bar, 2 µm.

114 Schémas hypothétiques d'organisation des chromosomes dans le noyau
Fixation du chromosome à l'enveloppe nucléaire Existence d'un "nucléosquelette"

115 1 - Fixation du chromosome à l'enveloppe nucléaire
Par leurs télomère par exemple Toutefois position non fixe dans le noyau

116 Lundi 10 décembre 2007 Noyaux d'embryons de drosophile : localisations de deux régions différentes (jaune et magenta) du chromosome 2 proches de l'enveloppe nucléaire (AC antilamina en vert) Fig 4-61

117 2 - Existence d'un"nucléosquelette" (1de2)
"Matrice" nucléaire "Charpente nucléaire" (ce qui reste après extraction) Certaines des protéines peuvent se lier à des séquences spécifiques de l'ADN appelées SARs (Scaffold Associated Regions)ou MARs (Matrix Associated Regions)…

118 2 - Existence d'un"nucléosquelette" (2de2)
…Formeraient la base des boucles Existence in vivo ? Organisation des chromosomes  localisation des gènes  expression des gènes