La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

Evaluation comparative de la MRD de LAL en Cytométrie en flux (4 couleurs) (N. Robillard, R.Garand, CHU, Nantes) et en biologie moléculaire (PCR/IgH-TCR.

Présentations similaires


Présentation au sujet: "Evaluation comparative de la MRD de LAL en Cytométrie en flux (4 couleurs) (N. Robillard, R.Garand, CHU, Nantes) et en biologie moléculaire (PCR/IgH-TCR."— Transcription de la présentation:

1 Evaluation comparative de la MRD de LAL en Cytométrie en flux (4 couleurs) (N. Robillard, R.Garand, CHU, Nantes) et en biologie moléculaire (PCR/IgH-TCR compétitive) (H.Cave, Hôpital Robert Debré, Paris) CMF:151 patients(345 prélèvements) PCR:120 patients(202 prélèvements) 1 aout 2007 Nantes:128 patients (300 prélèvements) Patients consécutifs, non sélectionnés Extérieurs:23 patients(45 prélèvements) (7 centres) Patients testés en CMF car PCR problématique N.Nés: 14 cas, Enfants: 127 cas, Adultes: 10 cas

2 hyper CD10++ instable 53% hypo CD20- (10+) médiocre 42% hyper CD22++ médiocre 30% hyper CD34++homogène médiocre 50% hypo CD24+diminué bon 31% (84) hypo CD38+diminué bon 54% hypo CD45+diminué bon 37% hyper CD58++ bon 73% hyper CD123++ bon 60% (66) asynchro. CD21+ CD10+ bon 14% (85) asynchro. CD20+/79b+ CD34+ bon 13% illégitime My (13,15,33,117) bon 29% illégitime T (2/4/5/7) bon 3% marq. « Leucémiques » (LAP) – LAL B (Nantes; dg: )(n= 225) 1 aout 2007 nombre de LAP pour MRD (n= 112) n LAP CD10 + n=96 CD10 - n= %100%

3 #1 Hématones CD58-PE CD10-FITC CD123-PE #2 LAL-B-CD10+ #3 LAL-B-CD10+ Gate: CD19+ 0% 99% 95% 99% CD38-PE 99% 5% 95% 99% 90% 1 aout 2007

4 hypoCD2- CD4- CD8-moyen (<0,1%)33% hyperCD4+ CD8+moyen (<0,2%)21% immaturitéCD3- cCD3+ CD5+moyen (<0,1%)63% immaturitéCD45+dimbon (<0,01%)60% hyperCD99+bon (<0,01%)77% immaturitéCD34++bon (<0,05%)30% immaturitéTdT+bon (<0,01%)70% immaturitéCD1a+bon (<0,01%)42% illégitimeCD10bon (<0,01%)21% illégitimeMy (13,15,33,117)moyen (<0,1%)30% marq. « Leucémiques » (LAP) – LAL T (Nantes+ext.; dg: )(n= 43) 1 aout 2007 n LAPLAL-T (n=43) 2 96%

5 Ly (CD45++)Blastes T (CD45+interm.) CLO Fab LALTIII CD3- cCD3-APC CD99-PE cCD3-APC TdT-FITC 72% 92% 98% 79% 1 aout 2007

6 Combinaisons danticorps (4 couleurs) utilisées pour la détermination de la MRD des LAL-B de l enfant Au moins 2 combinaisons (+ 1 contrôle) : 96% des prélèvements 3(4) Ac.Mo. Constants, conjugués APC, PerCP & FITC CD19 APC – CD45 perCP – CD10 FITC* (* si LAL-B CD10-: ajout du CD20 FITC ) 4e Ac.Mo. Variable, conjugué PE contrôle PE CD20 PE / CD34 PE / CD38 PE / CD58 PE / CD123 PE CD11a / CD21 PE / CD22 PE / CD24 PE / CD79b PE CD2 PE / CD4 PE / CD5 PE CD13 PE / CD33 PE / CD36 PE / CD117 PE 1 aout 2007

7 Combinaisons danticorps (4 couleurs) utilisées pour la détermination de la MRD des LAL-T de l enfant Au moins 2 combinaisons (+ 1 contrôle) : 76 / 85 (90%) des prélèvements LAL-T CD3- cCD3 apc -CD3 pc7 -CD5 pe -contrôle fitc cCD3 apc -CD3 pc7 -CD5 pe -TdT fitc cCD3 apc -CD3 pc7 -CD2/5/7/45 fitc -contrôle pe cCD3 apc -CD3 pc7 -CD2/5/7/45 fitc -CD99 pe cCD3 apc -CD3 pc7 -CD2/5/7/45 fitc -CD34 pe cCD3 apc -CD3 pc7 -CD2/5/7/45 fitc -CD1a pe cCD3 apc -CD3 pc7 -CD2/5/7/45 fitc -CD10 pe cCD3 apc -CD3 pc7 -CD2/5/7/45 fitc -CD13/33/117 pe LAL-T CD3+ Combinaisons « à la carte ». Incluant, par exemple: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, TdT, CD56, CD99, T … 1 aout 2007

8 Marquage à 4 couleurs (PerCP, APC, PE, FITC) (FACScalibur, BD, USA) En acquisition sélective (« live-gating »): - des cellules CD19+ totales si LALB - des cellules cCD3+ totales si LALT CD3- ou CD3+ totales si LALT CD3+ Puis quantification par fenêtrages successifs des cellules leucémiques *Selon Campana D, Constan-Smith E, Cytometry 38:139, 1999 Méthode* 1 aout 2007

9 1 e étape: exemple dune LAL-B CD10+ Réglages et compensations Traçage de la fenêtre de sélection (live gate) CD19+ Calcul du % de cellules B (hors débris) 95% 2,3% évènements cell. B totales (R1xR2): 2,2% cell. Nuclées totales 1 aout 2007

10 2 e étape: exemple dune LAL-B CD10+ avec MRD négative sélection des cell. B totales du tube (live gate CD19+) puis repérage et comptage des blastes leucémiques par multi-fenêtrage Blastes leucémiques (MRD)= %Btot.x (R2xR3xR4xR6)= 2,2% x 0,00% (<20 events)= 0% => MRD-LAL= <0,01% (seuil de sensibilité maxi.) évènements sélectionnés (/ 10 6 cell.) R6 Blastes leucémiques CD10+CD38+CD45- <0,01% cellules totales Hématogones CD10+CD38++CD45+/++ 2,1% cellules totales 1 aout 2007

11 LAL-B CD10+ testée avec 6 combinaisons (+ 1 contrôle) MRD 38+faible 34++ homogène 10++fort fort 45+faible Blastes leuc. : 76,3% des cell.B tot (Phénotype: CD10++ CD13+ CD20- CD22+ CD34++ CD38+ CD45-/+ CD58+) MRD: 0,58% cellules totales

12 MRD LAL - Faisabilité TechniqueOrigine des patients Éval./totalFaisabilité CMFNantes*123 / 12896% Autres**22 / 2396% total145 / 15196% PCRNantes*101 / 11687% IGH/TCR Autres**- ** * Patients consécutifs, non sélectionnés ** Patients testés en CMF pour MRD problématique en PCR 1 aout 2007

13 MRD LAL - Faisabilité selon le type immunologique* Type ImmunologiqueÉval./totalFaisabilité CMFB - CD10+84 / 8797% B – CD10- (MLL+: 12 / 13) 13 / 13100% T – imm. (TI, TII)8 / 8100% T – mat. (TIII, TIV)19 / 2190% PCRB - CD10+78 / 8295% IGH/TCR B – CD10- (MLL: 10 / 11) 5 / 1145%* TCR T – imm. (TI, TII)4 / 757% TCR T – mat. (TIII, TIV)18 / 2090% Patients de Nantes (consécutifs, non sélectionnés), uniquement *p< aout 2007

14 MRD LAL - Faisabilité Cause des échecs de la détermination de la MRD en CMF (9 prélèv.(3%); 6 patients (4%)) #EGILcausePt de MRD inéval. N1 B2 / CD10+ Sensib. Insuffis. (2LAP:22++,34++) Excès dhématogones (7%) 1 / 2 (J70) (J35: OK) N2B2 / CD10+ Sensib. Insuffis.(1LAP: CD20-) Excès dhématogones (4-13%) 3 / 4 (J70,227,372) (J35: OK) N3B2 / CD10+ Absence de LAP1 / 1 (J35) N4T4 / CD3+T + Sensib. Insuffis.(CD2- T +) Excès de T + normaux 1 / 3 (J117 post-allo.) (J34,J57: OK=MRD++) N5T4 / CD3+T + Sensib. Insuffis.(T +) Résultats trop incertains 2 / 3 (J59,101) (J31: OK=MRD++) E5T3 CD3- /CD3+T + 2 clones de phénotype impossible à distinguer 1 / 1 (J182) MRD ok en PCR-IG/TCR: 7 / 9 (78%) prélèvements 1 aout 2007

15 MRD LAL - Faisabilité de la CMF en cas de PCR IGH/TCR problématique Type Immuno. B-CD10+ B–CD10- T–immature / TCR-* T–mature / TCR+* Total CMF évaluable Total PCR problèm. n. (%) Cas n. prélèv 9 (26%)20 9 (26%)28 9 (26%)29 7 (22%) % *surface T-cell receptor (CD3/T /T 1 aout 2007

16 MRD LAL - Sensibilité de la CMF Selon le type immunologique - nombre de prélèvements= 328/337 (97%)* - TypenMRD négativeMRD positive Immuno. <0,01%<0,1%0,01% –0,1%0,1% –1%>1% B-CD % 19 10% % 10 B–CD % 4 10% 69 55% 7 T % 15 19%** % 7 Total % 38 12% 28 9% 33 10% 24 7% *prélèvements inévaluables en CMF exclus – n= 9 (3%) **comparaison MRD <0,1% LALT v LALB (tout type) p=0,03 (X2 test) 1 aout 2007

17 MRD LAL - Sensibilité de la CMF Selon le point de suivi (nombre de prélèvements= 342*) *prélèvements inévaluables en CMF exclus, **biaisés (fait en cas de pb clinique ou de cyto) ***comparaison MRD1 v MRD2: p=0.01 (X2 test) Pt de suivinMRD négativeMRD positive <0,01%<0,1%0,01% –0,1%0,1% –1%>1% MRD-J21** (Per-induc.) MRD-J35 (post-induc.) % 75 63% 0 0% 7 6% % 13 31% 4 16 MRD-J90 (conso.1) % 18 18%*** 95 20% 5 MRD3** (tardif) % 8 10% % 2 MRD4** (post-allo.) % 4 12% 44 26% 1 1 aout 2007

18 MRD LAL - Fiabilité de la CMF Comparaison des résultats de MRD des prélèvements étudiés en PCR IGH/TCR et en CMF parallèlement (tandem study) (nombre de prélèvements évaluables= 165) Concordance CMF=PCR 15594% Discordance CMF1% MRD4: CMF+:0,07% /PCR+ 0,1-0,5% MRD4: CMF+:0,01% /PCR+ 0,1% MRD1: CMF+:0,25% /PCR+>1% MRD4: CMF+:<0,1% /PCR+ 0,5-1% MRD1: CMF+:0,32% /PCR+>1% MRD4: CMF+:<0,1% /PCR+ 0,1-0,5% Discordance CMF>PCR 32% T3ab (3LAP)(Rech.) B-CD10+ (3LAP) MRD1: CMF+:0,20% /PCR+<0.1% MRD2: CMF+:0,32% /PCR+<0,1% MRD1: CMF+:0,34% /PCR+<0.1% 1 aout 2007

19 Conclusions Excellente concordance des résultats de MRD en CMF-4 couleurs et PCR IGH-TCR compétitive (94%) En cas de discordance, le niveau de MRD en CMF est généralement plus faible quen PCR Applicabilité de la CMF supérieure à celle de la PCR (95% versus 87%), particulièrement pour les LAL-B CD10- et les LAL-T immatures CMF-4 couleurs plus rapide, plus simple (et moins coûteuse?) que la PCR quantitative mais fiabilité des résultats dépendant du nombre et, surtout de la qualité (sensibilité et stabilité) des marq. leucémiques testés, tant en CMF, quen PCR limites de la CMF: Qualité des prélèv. (viabilité cellulaire++) & Reproductibilité inter-labo. de la CMF?


Télécharger ppt "Evaluation comparative de la MRD de LAL en Cytométrie en flux (4 couleurs) (N. Robillard, R.Garand, CHU, Nantes) et en biologie moléculaire (PCR/IgH-TCR."

Présentations similaires


Annonces Google