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Paramètres à considérer -Les plantes produisent déjà les précurseurs, cest-à-dire lacide linoléϊque (18:2n-6) et lacide α-linolénique (18:3n-3) 16:0 palmitic.

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1 Paramètres à considérer -Les plantes produisent déjà les précurseurs, cest-à-dire lacide linoléϊque (18:2n-6) et lacide α-linolénique (18:3n-3) 16:0 palmitic 18:0 stearic 16:1 palmitoleic 18:1 oleic 18:2n-6 linoleic 18:3n-3 α-linolenic elo Δ7des Δ12des Δ15des Δ9des Omega 6 Omega 3

2 Paramètres à considérer -Les plantes produisent déjà les précurseurs, cest-à-dire lacide linoléϊque (18:2n-6) et lacide α-linolénique (18:3n-3) -Pour transformer les acides gras de plantes en LC-PUFAs il faut plusieurs enzymes (désaturases, élongases, mais aussi des acyltransférases, et des enzymes dactivation des acides gras) -Ceci nécessite donc de transformer des plantes oléagineuses avec plusieurs gènes difficultés technologiques 16:0 palmitic 18:0 stearic 16:1 palmitoleic 18:1 oleic 18:2n-6 linoleic 18:3n-3 α-linolenic elo Δ7des Δ12des Δ15des Δ9des Omega 6 Omega 3 20:3n-3 22:6n-3 docosahexaenoic, DHA 18:4n-3 stearidonic 20:4n-3 eicosatetraenoic 20:5n-3 eicosapentaenoic, EPA 22:5n-3 ω3-docosapentaenoic Δ9elo Δ8des Δ6des Δ6elo Δ5des Δ4des eicosatrienoic Δ5elo

3 18:3n-3PC α-linolenic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine 18:4n-3 PC 20:4n-3CoA 20:5n-3 PC EPA Δ6des Δ6elo Δ5des Stearidonic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine 18:4n-3CoA LPCAT* *Δ6-specific lysophosphatidylcholine acyltransferase LPCAT* 20:4n-3 PC Eicosatetraenoic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine Eicosapentaenoic acid at sn-2 of lysophosphatidylcholine **Acyl-CoA synthetase 18:4n-3 ACS** Phospholipid pool Acyl-CoA pool Substrats des désaturases et des élongases

4 Les élongases -Complexe qui regroupe 4 enzymes -La première enzyme est responsable de la spécificité de substrat

5 Wallis et al., TIBS, 2002 Structure des LC-PUFAs désaturases (front-end desaturase, front = COOH) Amino acid sequences of membrane-bound fatty acid desaturases from plants, animals and other organisms have three strongly conserved histidine-rich sequences (His boxes) with the general motifs HXXXH, HXXHH and HXXHH. These boxes are required for enzyme activity and are separated by membrane-spanning domains that must provide the correct orientation for the active sequences. Many enzymes including the mammalian Δ5 and Δ6 desaturases contain a cytochrome b5-like N-terminal extension; this is often accompanied by a change in the third His box to QXXHH (as shown). Electrons acquired from NADH cytochrome b5 reductase are transferred to cytochrome b5 or the cytochrome b5 domain of the desaturase, and then to the active site of the desaturase. The mixed oxidation/reduction reaction proceeds through two iron atoms (green circles) that are stabilized by interaction with the conserved histidine boxes. (around 450 aa)

6 or Nannochloropsis oculata (Thalassiosira pseudonana) (Pavlova lutheri, Isochrysis galbana ) Les microalgues: une large gamme de choix Part of a maximum-likelihood tree constructed using 18S rRNA sequences (adapted from Lopez-Garcia P. et al., Nature, 2001) (Phaeodactylum tricornutum)

7 De nombreux articles décrivent des profils lipidiques de microalgues

8 eicosatrienoic Microalgues = source de gènes codant pour des élongases et des désaturases ActivitéAlgues et champignons marins Δ9eloIsochrysis galbana Δ8desEuglena gracilis Δ6desPhaeodactylum tricornutum Thalassiosira pseudonana Thraustochytrium sp… Δ6eloThalassiosira pseudonana Ostreococcus tauri… Δ5desPhaeodactylum tricornutum Thalassisoira pseudonana Thraustochytrium sp… Δ5eloThalassiosira pseudonana Ostreococcus tauri Pavlova lutheri Δ4desThraustochytrium sp Euglena gracilis Pavlova lutheri Thalasssiora pseudonana Isochrysis galbana 20:3n-3 20:4n-6 arachidonic 20:3n-6 dihomo-γ-linolenic 18:3n-6 γ-linolenic 20:2n-6 eicosadienoic 18:2n-6 linoleic 22:6n-3 docosahexaenoic, DHA 18:3n-3 α-linolenic 18:4n-3 stearidonic 20:4n-3 eicosatetraenoic 20:5n-3 eicosapentaenoic, EPA 22:5n-3 ω3-docosapentaenoic 22:4n-6 adrenic 22:5n-6 ω6-docosapentaenoic Δ9elo Δ6des Δ6elo Δ8des Δ15des Δ9elo Δ8des Δ6des Δ6elo Δ5elo Δ5des Δ4des Omega 6Omega 3 (18:2n-6 et 18:3n-3 are present in plants) Δ5elo Cette liste est loin dêtre exhaustive… Oméga 3 désaturase

9 Faisabilité de la reconstitution de la voie de synthèse du DHA chez un hôte hétérologue in Yeast 18:4n-3 Δ6elo: T. pseudonana Δ5des: P. tricornutum Δ5elo: O. tauri Δ4des: E. gracilis DHA DHA: ~ 0,5-1 % des AG totaux

10 - objectif: « Si une huile végétale contient environ 5% dARA, 5% dEPA et 5% de DHA, 10 g de cette huile (quantité suffisante pour préparer une vinaigrette) permettraient dingérer la quantité journalière suffisante de LC-PUFAs » Reconstitution de la voie de synthèse des oméga 3 chez les plantes 20:3n-3 20:4n-6 arachidonic 20:3n-6 dihomo-γ-linolenic 18:3n-6 γ-linolenic 20:2n-6 eicosadienoic 18:2n-6 linoleic 22:6n-3 docosahexaenoic, DHA 18:3n-3 α-linolenic 18:4n-3 stearidonic 20:4n-3 eicosatetraenoic 20:5n-3 eicosapentaenoic, EPA 22:5n-3 ω3-docosapentaenoic 22:4n-6 adrenic 22:5n-6 ω6-docosapentaenoic Δ9elo Δ6des Δ6elo Δ8des Δ15des Δ9elo Δ8des Δ6des Δ6elo Δ5elo Δ5des Δ4des Omega 6Omega 3 Δ5elo Domergue et al., TIPS, 2005 Arabidopsis thaliana colza lin tabac soja Oméga 3 désaturase

11 Volume 22, , :3n-3 18:3n-3 α-linolenic 18:4n-3 stearidonic 20:4n-3 eicosatetraenoic 20:5n-3 eicosapentaenoic, EPA Δ9elo: from I. galbana Δ8des: from E. gracilis Δ6des Δ6elo Δ5des: from Mortierella alpina eicosatrienoic X X - Promoteur constitutif - Transformation séquentielle

12 Ces résultats ont permis de démontrer la faisabilité de ce type dexpérience chez les plantes, mais production chez Arabidopsis et dans les feuilles

13 - promoteur spécifique des graines - une seule transformation meilleurs résultats avec la construction C 20:3n-3 18:3n-3 α-linolenic 18:4n-3 stearidonic 20:4n-3 eicosatetraenoic 20:5n-3 eicosapentaenoic, EPA Δ9elo Δ8des Δ6des from P. tricornutum Δ6elo from moss Δ5des from P. tricornutum eicosatrienoic X X

14 Production dEPA que chez le tabac, et dans les graines

15 20:4n-6 arachidonic 20:3n-6 dihomo-γ-linolenic 18:3n-6 γ-linolenic 18:2n-6 linoleic 22:6n-3 docosahexaenoic, DHA 18:3n-3 α-linolenic 18:4n-3 stearidonic 20:4n-3 eicosatetraenoic 20:5n-3 eicosapentaenoic, EPA 22:5n-3 ω3-docosapentaenoic 22:4n-6 adrenic 22:5n-6 ω6-docosapentaenoic Δ6des Δ15des Δ17des Δ6des Δ6elo Δ5elo Δ5des Δ4des Δ5elo Δ6elo Δ15des - Plante hôte = soja - Transformation dembryon somatique par biolistique - Promoteurs spécifiques des graines - Pour la production dEPA: 2 constructions testées (Saprolegnia diclina Δ6des + Mortierella alpina Δ6elo + Mortierella alpina Δ5des) (Arabidopsis thaliana Δ15des + Saprolegnia diclina Δ17des) - pour la production de DHA : 2 constructions testées (Saprolegnia diclina Δ6des + Mortierella alpina Δ6elo + Mortierella alpina Δ5des) (Pavlova sp. Δ5elo + Schizochitrium aggregatum Δ4des + Saprolegnia diclina Δ17des)

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17 Nouvelles stratégies pour augmenter la production de LC-PUFAs et le stockage dans les TAGs: - Acyl-transférases - Acyl-CoA synthétase specifiques de lEPA et du DHA ?

18 Production et stockage des LC-PUFAs Glycerol 3-P lysoPA PA DAG TAG G3PAT LPAAT PAPase DGAT PC lysoPC CPT LPCAT H H P FA 1 H P FA 2 P FA 1 FA 2 FA 3 acyl-CoA pool acyl-CoA PDAT Fatty acid synthesis: in plastid (until 18:1), and in endoplasmic reticulum 26:0 28:0 30:0 elo acyl-CoA synthetase FAs elo: elongase X: X-desaturase Kennedy pathway: AcylTransferases in endoplasmic reticulum

19 Addition de nouvelles enzymes: acyltransférases

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21 ARA: jusquà 25% EPA: jusquà 15%

22 Acyl-CoA synthétases de Thalassiosira pseudonana Thalassiosira pseudonana (Diatomée) Genomic DNA library CNAP server Acyl-CoA synthétase = activation des AG: AG + ATP + acyl-CoA acyl-CoA + AMP

23 Composition en AG et acyl-CoA de Thalassiosira pseudonana co-elution Tonon et al., Plant Physiology, 2005

24 namefull lengthintron TplacsAYes2 TplacsBYes, n-term frameshift ?2 TplacsCpartial, miss n-term>1 TplacsDpartial, miss n-term3 TplacsEpartial, miss both ends>2 TplacsFpartial, miss n-term>5 TplacsGpartial, miss n-term>5 TplacsIYes0 Acyl-CoA synthétases connues Tonon et al., Plant Physiology, 2005 Acyl-CoA synthétases de Thalassiosira pseudonana

25 t3t4 t2t1 TplacsA (324 bp) 18S rDNA (675 bp) TplacsI (543 bp) % nitrate degraded Incubation (h) t4 t3 t2t1Culture time Expression des gènes TpLACS expression hétérologue dans la levure Tonon et al., Plant Physiology, 2005

26 Expression de TplacsA dans les levures et incubation en présence de 18:4n3+20:5n3 Résultats similaires en présence de 18:3n6+20:4n6 TpLACSA peut activer les LC-PUFAs Time after feeding constructmol % acyl-CoA 14:016:016:1n718:018:1n-918:4n-320:5n-322:1n-9 t0pYES21.4± ± ±3.10.7± ±2.6n.d. 4.7±0.3 pYLACSA2.2±0.11.5± ±1.30.6± ±2.0n.d. 5.6±0.3 5 minpYES21.5± ±2.00.4± ±2.00.3±0.1n.d.4.3±0.3 pYLACSA2.3±0.21.2± ±1.40.4± ±0.51.3±0.21.6±0.56.2± minpYES21.4±0.12.4± ±3.30.6± ±2.70.5±0.1n.d.4.6±0.2 pYLACSA3.3±0.62.1± ±1.70.5±0.18.9±0.82.3±0.71.4±0.47.1± hpYES21.2±0.24.9± ±0.71.1±0.17.4±0.30.5±0.10.2±0.07.8±0.5 pYLACSA2.8±0.59.7± ±3.94.1±0.76.8±0.21.3±0.23.6±1.08.3±1.0 Tonon et al., Plant Physiology, 2005

27 Fatty acid substrate Yeast extracts specific activity (pmole/min/mg protein) PACS specific activity (pmole/min/mg protein) 16:0 18:3n-6 18:4n-3 20:4n-6 20:5n-3 22:6n-3 Activité spécifique de TpLACSA PACS = Pseudomanas sp. acyl-CoA synthetase (Sigma), connue pour son spectre large dactivité TpLACSA est très active sur les LC-PUFAs, en particulier le DHA Tonon et al., Plant Physiology, pYES2 pYLACSA PACS

28 Parameters consideredpYES2pYLACSA % of FA incorporated in TAGs 50±163±40 nanomoles of FA incorporated in TAG per mg dried weight 140±13272±28 % of DHA incorporated in TAG 54±281±5 nanomoles of DHA incorporated in TAG per mg dried weight13±186±10 TpLACSA peut-elle augmenter le stockage du DHA dans la levure? La réponse est oui prochaine étape = expression chez la plante Tonon et al., Plant Physiology, 2005

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