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II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes.

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1 II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes

2 2 Généralités Techniques de microscopie optiques (les moins traumatisantes) Marquage fluorescent des molécules à suivre

3 3 Concentrations ioniques Microélectrodes (H +, Na +, K +, Cl -, Ca ++ ) mais pas rapide Indicateurs sensibles aux ions –luminescents (aequorine de la méduse) –fluorescents

4 4 Fig 9-38 Aequorine : protéine luminescente en fonction de [Ca ++ ] libre entre 0,5 et 10 M –injection d'aequorine puis –fécondation –photo toutes les 4 secondes Libération de [Ca ++ ] dans le cytoplasme Mais très faible intensité

5 5 Fig 9-39 Cellule de Purkinje Indicateur fluorescent sensible à [Ca ++ ] (fura-2) [Ca ++ ] intra cellulaire en fluorescence –rouge : forte [Ca ++ ] (dendrites) –bleu : faible [Ca ++ ]

6 6 Autres indicateurs fluorescents Autres ions

7 7 Injection intra-cytoplasmique de molécules marqueur Anticorps Protéine cellulaire purifiée marquée Exemple tubuline

8 8 Fig tubuline

9 9 Fig tubuline

10 10 Injection intra-cytoplasmique de molécules pour bloquer une fonction Anticorps anti myosine-II dans un œuf d'oursin bloque la division sans bloquer la mitose

11 11 Quatre méthodes d'introduction de molécules dans la cellule Microinjection Électroporation Vésiculation Projection à haute vitesse…

12 12 Fig 9-40 (AB)

13 13 Fig 9-40 (CD)

14 14 Molécules captives Synthèse d'une forme inactive de la molécule Introduction dans la cellule Activation à un temps et moment donné par un faisceau lumineux eg : molécules captives pour Ca ++, AMPc, GTP, IP 3

15 15 Fig 9-41 Caged molecules La molécule X devient active après le flash d'UV

16 16 Application Molécules fluorescentes piégées Grosse modification de la molécule qui doit rester active grosse difficulté Tâtonnement pour créer de nouvelles molécules eg : tubuline

17 17 Fig 9-42 Caged tubuline fluorescéine Tubuline rhodamine (rouge) Dapi ADN (bleu) Tubuline flourescéine piégée (mélangée aux autres et invisible avant le rayon d'UV) Avant UV Après UV juste à gauche de la plaque métaphasique Après 1,5 mnAprès 2,5 mn

18 18

19 19

20 20

21 21

22 22 Desai,A1998

23 23

24 24 Green Fluorescence Protein

25 25 Fig 9-43 GFP

26 26 GFP 3D

27 27 GFP Topol GFP

28 28 GFP mice

29 29 Fig 9-44 GFP tagging

30 30 GFP

31 31 Fig 9-45 Dynamics of GFP tagging

32 32 Isolement Séparation (FACS) Culture primaire et secondaire Milieu de culture Lignée cellulaire Transformation Congélation Clone Hybride III - Culture cellulaire

33 33 Facs

34 34 Hybride cellulaire

35 35 Production AC monoclonaux

36 36 Culture SEM

37 37 Immuno gold en ME ME Immuno-gold

38 38 Pulse-chase Patch-Clamp Molécules « piégées » Les anticorps –immunofluorescence directe –immunofluorescence indirecte Pistage de molécules dans la cellule

39 39 Fig 9-46

40 40 Fig 9-47 Autoradiographie en microscopie électronique 5 mn de pulse de 3 HLeucine dans cellules B de pancréas Après 10 mn de chasseAprès 45 mn de chasse

41 41 Fig 9-48

42 42 Techniques biochimiques IV - Fractionnement des cellules et analyse des molécules


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