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La plate-forme Protéomique Génopole Toulouse Midi-Pyrénées RIO Bernard Monsarrat – IPBS/CNRS.

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1 La plate-forme Protéomique Génopole Toulouse Midi-Pyrénées RIO Bernard Monsarrat – IPBS/CNRS

2 Proteomics Platform From proteinsto function …… 2D Gel Electrophoresis Robotization Packard Multiprobe II Scanners Typhoon Peptide Mass Fingerprinting ABI MALDI Tof-Tof Peptide Sequencing Protein Characterization ThermoFisher Orbitrap Posttranlational Modifications ABI Q-TRAP Quantitative Proteomics ABI Q-STAR Biomolecular Interactions Biacore 3000, X Bioinformatics SQL-LIMS Mascot In-house software RIO Label Toulouse Midi-Pyrénées TechnicalSkills

3 IFR 40 IFR 109 IFR 31 IFR 30 IPBS ICR La Plateforme Génopole Toulouse Midi-Pyrénées

4 Renaud Albigot - Bioinformatics David Bouyssié - PhD in Bioinformatics Emmanuelle Mouton - Bioinformatics Karima Chaoui - Biochemistry and Mass Spectrometry Florence Dalvai - Biochemistry and Mass Spectrometry Carine Froment - Biochemistry and Mass Spectrometry Carole Pichereaux - Biochemistry and Mass Spectrometry Michel Rossignol - Biochemistry and Mass Spectrometry Alexandre Stella - Biochemistry and Mass Spectrometry Ludovic Canelle - Post-doc, Marie-Pierre Bousquet - Researcher Anne Gonzalez de Peredo – Researcher Bernard Monsarrat Coordination Mariette Matondo - PhD student Odile Schiltz – Researcher Sandrine Uttenweiler – Researcher J.P. Estève and F. Lopez (IFR 31), F. Pont (IFR 30), P. Valenti (IFR 109), A. Cuider (ICR) The Proteomics Platform - Staff

5 Patterson, S.D. & Aebersold, R.H (2003) Nature Genetics Differential Proteomics Differential Proteomics Interacting Proteins Interacting Proteins Post-Translational Modifications Post-Translational Modifications Challenges in Proteomics

6 Mise en place dune nouvelle génération dinstruments : - LTQ-FT-Orbitrap Développement de nouvelles stratégies : - Identification de protéines de faible abondance

7 Un spectromètre de masse hybride de nouvelle génération : LTQ-FT-Orbitrap Mass resolution > 60,000 (FWHM) at m/z 400 at 1 sec cycle Max. resolution > 100,000 at m/z 400 in a full scan Mass accuracy < 5 ppm external calibration (2 days old) < 2 ppm internal calibration (lock mass) Mass range: 50 – 2,000; 200 – 4,000 Sensitivity: sub-femtomol on column Dynamic range: 3000 in a single scan Throughput: 3 accurate mass scans per second or 4 scans per second parallel detection (1 HR Orbitrap scan + 3 LR LTQ MS/MS scans) IPBS Toulouse : Inst 15/09, Recept. 20/

8 Mouvement des ions dans lOrbitrap comment maintenir des ions stables, dans un champ électrostatique comment maintenir des ions stables, dans un champ électrostatique Dr. Alexander Makarov, Dr. Alexander Makarov,

9 Paramètres affectant le degré de couverture dun protéome 100 g total protein lysate 100 copy/cell 20 fmol Trap filled with ions Detection of signal ~ 500 ions Dynamic range ~ 10 4 Eucaryotic cells : ~ Biological fluids : ~ (serum) Red blood cell : 97-98% haemoglobin 2% other proteins de Godoy et al. Genome Biol Low abundance peptides not picked for MS/MS: 60% Reduction de la gamme dynamique ?

10 ETUDE DU «PROTEOME CACHE» DE LERYTHROCYTE PAR LIGANDS PEPTIDIQUES COMBINATOIRES ET LC-MS/MS SUR LTQ-FT-ORBITRAP Echantillon protéique Large gamme dynamique RBC : 98% dhémoglobine 64 millions de ligands peptidiques Flow-Through : Majeure partie des protéines de haute abondance Eluat : Réduction de la gamme dynamique « Equalization des érythrocytes » Collaboration : E. Boschetti (R&D), BioRad

11 SE-Beads E-Beads Elution TUC Elution UH Organic elution SE-Beads Elution TUC Elution UH -NH2 -COOH Start E1 E2 E3S1 S2 S3 FT Organic elution RBC lysat fraction Soluble « Equalization des érythrocytes » 250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa 50 kDa 37 kDa 25 kDa 20 kDa 15 kDa 10 kDa MqStartFTE1S1E2S2E3S3 SDS-PAGE analytique

12 « Equalization des érythrocytes » N° spots: 80 (1300 g) Silver staining N° spots: 950 (640 g) Silver staining E1+E2+E3+S1+S2+S3Start

13 Start : 2mg E1 : 100µg E2 : 100µg E3 : 100µg S1 : 100µg S2 : 100µg S3 : total SDS-PAGE gel Cut 20 bands per sample Trypsin digestion NanoLC-MSMS on LTQ-Orbitrap 1 MS Orbitrap reso= MSMS Ion trap (Data Depedent Acquisition) Analyse par nanoLC-MSMS LTQ-FT-Orbitrap Mascot 2.0 : Search in IPI human MFPaQ : Protein Validation False Postive Rate: 0.7% MFPaQ : Bouyssié et al. Mol. Cell. Prot., 2007 Effet de lEqualization sur MS/MS des peptides ?

14 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Before equalization After equalization Number of identified peptides decreases after equalization More time for minor peptides sequencing Effect of equalization on high abundance proteins

15 Hepatoma-derived growth factor Before equalizationAfter equalization Effect of equalization on low abundance proteins Number of identified peptides increases after equalization + sequencing of additional proteins

16 Après Equalization E1+E2+E3+S1+S2+S3 fractions 1587 proteins Avant Equalization « Start » fraction 540 proteins Identifications : 1647 proteines ! Pasini et al MCP 2006 : 252 Avant versus Après « Equalization » NanoLC-MSMS on LTQ-Orbitrap

17 Analyse systématique : Evolution des approches protéomiques Identification de l'ensemble des protéines d'un système Analyse fonctionnelle : Quantification relative d'un ensemble de protéines dans deux conditions distinctes Interactions protéine/protéine : Caractérisation des partenaires protéiques au sein dun complexe Analyse fonctionnelle ciblée : (Bioinformatique) Analyse différentielle : ( Bioinformatique ) Modifications post-traductionnelles Etude différentielle de sous-protéomes Quantification absolue de protéines dintérêt

18 Réseau National des Génopoles CNRS, Région Midi-Pyrénées Remerciements Pôle de Compétitivité Cancer Bio Santé Cancéropole GSO, INCa FRM, ANR… CPER 2007_2013, Protéomique : 5.2 M


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