La plate-forme Protéomique Génopole Toulouse Midi-Pyrénées

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1 La plate-forme Protéomique Génopole Toulouse Midi-Pyrénées
Bernard Monsarrat – IPBS/CNRS RIO

2 Toulouse Midi-Pyrénées
Proteomics Platform Toulouse Midi-Pyrénées RIO Label From proteins …… to function Bioinformatics SQL-LIMS Mascot In-house software Technical Skills Biomolecular Interactions Biacore 3000, X 2D Gel Electrophoresis Scanners Typhoon Quantitative Proteomics ABI Q-STAR Robotization Packard Multiprobe II Posttranlational Modifications ABI Q-TRAP Peptide Sequencing Protein Characterization ThermoFisher Orbitrap Peptide Mass Fingerprinting ABI MALDI Tof-Tof

3 La Plateforme Génopole Toulouse Midi-Pyrénées
ICR IFR 30 IFR 31 IFR 109 IPBS IFR 40

4 The Proteomics Platform - Staff
Renaud Albigot - Bioinformatics David Bouyssié - PhD in Bioinformatics Emmanuelle Mouton - Bioinformatics Karima Chaoui - Biochemistry and Mass Spectrometry Florence Dalvai - Biochemistry and Mass Spectrometry Carine Froment - Biochemistry and Mass Spectrometry Carole Pichereaux - Biochemistry and Mass Spectrometry Michel Rossignol - Biochemistry and Mass Spectrometry Alexandre Stella - Biochemistry and Mass Spectrometry Ludovic Canelle - Post-doc, Marie-Pierre Bousquet - Researcher Anne Gonzalez de Peredo – Researcher Bernard Monsarrat Coordination Mariette Matondo - PhD student Odile Schiltz – Researcher Sandrine Uttenweiler – Researcher J.P. Estève and F. Lopez (IFR 31), F. Pont (IFR 30), P. Valenti (IFR 109), A. Cuider (ICR)

5 Challenges in Proteomics
Patterson, S.D. & Aebersold, R.H (2003) Nature Genetics Interacting Proteins Post-Translational Modifications Differential Proteomics

6 Mise en place d’une nouvelle génération d’instruments : - LTQ-FT-Orbitrap Développement de nouvelles stratégies : - Identification de protéines de faible abondance

7 Un spectromètre de masse hybride de nouvelle génération : LTQ-FT-Orbitrap
Mass resolution > 60,000 (FWHM) at m/z 400 at 1 sec cycle Max. resolution > 100,000 at m/z 400 in a full scan Mass accuracy < 5 ppm external calibration (2 days old) < 2 ppm internal calibration (lock mass) Mass range : 50 – 2,000; 200 – 4,000 Sensitivity : sub-femtomol on column Dynamic range : in a single scan Throughput : 3 accurate mass scans per second or 4 scans per second parallel detection (1 HR Orbitrap scan + 3 LR LTQ MS/MS scans) IPBS Toulouse : Inst 15/09, Recept. 20/

8 Mouvement des ions dans l’Orbitrap
“ comment maintenir des ions stables, dans un champ électrostatique” Dr. Alexander Makarov,

9 Paramètres affectant le degré de couverture d’un protéome
100mg total protein lysate ↔100 copy/cell ↔ 20 fmol de Godoy et al. Genome Biol. 2006 Eucaryotic cells : ~ Biological fluids : ~ 1010 (serum) Red blood cell : 97-98% haemoglobin 2% other proteins Low abundance peptides not picked for MS/MS: 60% Trap filled with ions Detection of signal ~ 500 ions Dynamic range ~ 104 Reduction de la gamme dynamique ?

10 « Equalization des érythrocytes »
ETUDE DU «PROTEOME CACHE» DE L’ERYTHROCYTE PAR LIGANDS PEPTIDIQUES COMBINATOIRES ET LC-MS/MS SUR LTQ-FT-ORBITRAP « Equalization des érythrocytes » Echantillon protéique Large gamme dynamique RBC : 98% d’hémoglobine Eluat : Réduction de la gamme dynamique 64 millions de ligands peptidiques Flow-Through : Majeure partie des protéines de haute abondance Collaboration : E. Boschetti (R&D), BioRad

11 « Equalization des érythrocytes »
E-Beads SE-Beads E-Beads SE-Beads RBC lysat fraction Soluble -NH2 -COOH Elution TUC Start Organic elution Elution TUC Organic elution FT Elution UH E1 E3 S1 Elution UH S3 E2 S2 250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa 50 kDa 37 kDa 25 kDa 20 kDa 15 kDa 10 kDa Mq Start FT E1 S1 E2 S2 E3 S3 SDS-PAGE analytique

12 « Equalization des érythrocytes »
Start E1+E2+E3+S1+S2+S3 N° spots: 80 (1300 g) Silver staining N° spots: 950 (640 g) Silver staining

13 Analyse par nanoLC-MSMS LTQ-FT-Orbitrap
Start : 2mg E1 : 100µg E2 : 100µg E3 : 100µg S1 : 100µg S2 : 100µg S3 : total SDS-PAGE gel Cut 20 bands per sample Trypsin digestion NanoLC-MSMS on LTQ-Orbitrap 1 MS Orbitrap reso=60000 5 MSMS Ion trap (Data Depedent Acquisition) MFPaQ : Protein Validation False Postive Rate: 0.7% Mascot 2.0 : Search in IPI human MFPaQ : Bouyssié et al. Mol. Cell. Prot., 2007 Effet de l’”Equalization” sur MS/MS des peptides ?

14 Effect of equalization on high abundance proteins
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Before equalization After equalization Number of identified peptides decreases after equalization More time for minor peptides sequencing

15 Effect of equalization on low abundance proteins
Hepatoma-derived growth factor Before equalization After equalization Number of identified peptides increases after equalization + sequencing of additional proteins

16 Avant versus Après « Equalization »
Avant Equalization « Start » fraction 540 proteins Après Equalization E1+E2+E3+S1+S2+S3 fractions 1587 proteins 1107 480 60 NanoLC-MSMS on LTQ-Orbitrap Identifications : 1647 proteines ! Pasini et al MCP 2006 : 252

17 Evolution des approches protéomiques
 Analyse systématique : Identification de l'ensemble des protéines d'un système  Analyse fonctionnelle : Interactions protéine/protéine : Caractérisation des partenaires protéiques au sein d’un complexe Modifications post-traductionnelles Analyse différentielle : (Bioinformatique) Quantification relative d'un ensemble de protéines dans deux conditions distinctes  Analyse fonctionnelle ciblée : (Bioinformatique) Etude différentielle de sous-protéomes Quantification absolue de protéines d’intérêt

18 Remerciements Réseau National des Génopoles CNRS, Région Midi-Pyrénées
Pôle de Compétitivité Cancer Bio Santé Cancéropole GSO, INCa FRM, ANR… CPER 2007_2013, Protéomique : 5.2 M€