Thérapies Génique et Cellulaire du Diabète Florence SUAVET

Plan Généralités La thérapie génique Le diabète Les vecteurs utilisés en thérapie génique Exemple de thérapie génique Le diabète Thérapie génique Thérapie cellulaire

Qu’est ce que la thérapie génique ? Introduction de séquences d’acides nucléiques (soit naturelles, soit artificielles) dans des cellules en vue de modifier l’expression d’un gène à des fins thérapeutiques

Cancer de la prostate Maladie d'Alzheimer Susceptibilité à la dyslexie Chromosome 1 Cataracte congénitale Maladie de Charcot Surdité de perception dominante Prédisposition au cancer du poumon à petites cellules Glaucome primaire à angle ouvert Cancer de la prostate Maladie d'Alzheimer Susceptibilité à la dyslexie Chromosome 2 Glaucome congénital Cancer du colon Gène freinant la croissance musculaire Prédisposition au diabète sucré insulino-dépendant Cataracte congénitale dominante Diabète sucré non insulino-dépendant Cécité nocturne congénitale Chromosome 3 Prédisposition à la schizophrénie Cancer du côlon Cécité nocturne congénitale stationnaire Cancer familial du rein Maladie inflammatoire de l'intestin Surdité de perception récessive Alcaptonurie Obésité sévère Intolérance au saccharose Chromosome 4 Nanisme Chorée de Huntington Surdité de perception dominante Diabète (atrophie optique, surdité) Prédisposition à l'alcoolisme Psychose maniaco-dépressive Prédisposition au psoriasis Prédisposition familiale à la maladie de Parkinson Chromosome 5 Déficit de l'attention et hyperactivité Nanisme hypophysaire résistant à l'hormone de croissance Facteur de prédisposition à la sclérose en plaques Résistance aux corticoïdes Prédisposition à la schistosomiase Chromosome 6 Prédisposition à la schizophrénie Spondylarthrite ankylosante Hémochromatose Prédisposition à la sclérose en plaques Susceptibilité à la dyslexie Athérosclérose coronarienne Chromosome 7 Cancer du côlon Nanisme hypophysaire Glioblastome multiforme Maladie des os de verre Autisme / Surdité de perception récessive Mucoviscidose Prédisposition à l'obésité Prédisposition à la schizophrénie Chromosome 8 épilepsie précoce Maladie de Werner Alopécie universelle héréditaire Prédisposition à la schizophrénie Prédisposition à l'épilepsie généralisée Goitre Convulsions néonatales familiales bénignes

Chromosome 9 Albinisme oculo-cutané / Mélanome cutané malin / Galactosémie (impossibilité pour les enfants de digérer le lait) / Hypomagnésémie / Hirsutisme / Système sanguin ABO / Intolérance au fructose Chromosome 10 Fente labiopalatine / épilepsie partielle avec manifestations auditives / Surdité de perception auditive / Vitiligo / Obésité sévère / Atrophie de la choraïde et de la rétine Chromosome 11 Prédisposition au diabète sucré insulino-dépendant / Thalassémie-béta / Drépanocytose / Aniridie / Surdité de perception dominante / Albinisme oculo-cutané / Hyperlipidémie complexe / Psychose maniaco-dépressive Arythmie cardiaque Chromosome 12 Prédisposition aux maladies inflammatoires de l'intestin / Rachitisme vitaminodépendant / Rachitisme vitaminorésistant / Hyperimmunoglobuline E et asthme / Diabète sucré non insulino-dépendant / Chromosome 13 Surdité dominante / Surdité récessive / Dystrophie musculaire de l'enfant / énurésie nocturne héréditaire / Cancer du sein à début précoce (gène BRCA2) / Rétinoblastome / Maladie de Wilson (encéphalopathie) Chromosome 14 Prédisposition à l'eczéma / Surdité de perception / Maladie d'Alzheimer / Prédisposition au diabète sucré insulino-dépendant / Hyperthyroïdie congénitale / Prédisposition à la sclérose en plaques / Emphysème, hépatite néonatale et cirrhose Chromosome 15 Susceptibilité à la dyslexie / Albinisme oculo-cutané tyrosinase positif / Maladie de Marfan / Athérosclérose coronarienne / Diabète sucré insulino-dépendant Chromosome 16 Psychose maniaco-dépressive Thalassémie-alpha Cataracte et microphtalmie Cataracte polaire postérieure Cataracte zonulaire dominante Maladie inflammatoire de l'intestin Hypertension

Chromosome 17 Prédisposition à tous les cancers Asthme sévère Prédisposition au psoriasis démence et amyotrophie Prédisposition au cancer du sein et de l'ovaire Prédisposition à la sclérose en plaques Risque d'infarctus du myocarde / Nanisme hypophysaire Diabète sucré non insulino-dépendant Chromosome 18 Psychose maniaco-dépressive Obésité précoce, cheveux roux Myopie importante Prédisposition à la sclérose en plaques Prédisposition au diabète sucré insulino-dépendant Cancer du côlon   Chromosome 19 Migraine hémiplégique Diabète sucré non insulino-dépendant résistant à l'insuline Hypercholestérolémie familiale / Crises migraineuses avec aura et lésions cérébrales Maladie d'Alzheimer à début tardif Athérosclérose coronarienne Chromosome 20 Déterminant quantitatif de la stature Insomnie, forme héréditaire de la maladie de Creutzfeldt-Jakob Diabète insulino-dépendant type tardif du sujet jeune Déficit immunitaire combiné sévère épilepsie frontale nocturne dominante Convulsions bénignes du nouveau-né Chromosome 21 Maladie d'Alzheimer Sclérose latérale amyotrophique Psychose maniaco-dépressive Syndrome de Down épilepsie myoclonique progressive Chromosome 22 Cardiopathies congénitales Syndrome de l'oeil de chat Prédisposition à la schizophrénie Autisme, retard mental Malabsorption du glucose et du galactose   Chromosome X Prédisposition à la schizophrénie Maladie de Duchenne de Boulogne /Myopie /Goutte /Psychose maniaco-dépressive Hémophilie type A et B Cécité aux couleurs monochromatiques cécité au vert 41 gènes impliqués dans le retard mental lié à l'X Chromosome Y Facteur déterminant dans la régulation des gènes contrôlant le développement des testicules - Dysgénésie gonadique (femme XY) Azoospermie

La thérapie génique Généralités Les vecteurs viraux Les adénovirus et les adéno-associés (AAV) Les rétrovirus et les lentivirus Les vecteurs non viraux ADN nu Lipides et polymères

Notion de génothérapie germinale et somatique Génothérapie germinale : correction dans une cellule germinale ou une cellule de l’embryon précoce Génothérapie somatique : correction phénotypique d’un groupe de cellules déterminé

Pathologies cibles Maladies génétiques (mucoviscidose, pathologies du système immunitaire, etc) remplacer le gène altéré Pathologies acquises (cancers, maladies infectieuses, pathologies cardiovasculaires…)

Transfert de gènes : les objectifs Introduire un nouveau gène pour pallier les effets d’un gène défectif (ex : désordres héréditaires) Introduire un gène normalement absent du génome humain (ex : vaccination) Introduire un gène cellulaire dans le but d’augmenter le niveau de son expression Réduire l’expression délétère d’un gène (oligonucléotides anti-sens)

But Une administration unique d’une version « corrigée » du gène résulterait de façon définitive en une correction du déficit génétique et en une correction de la maladie.

Essais en cours Cancers Déficit immunitaire SCID (déficit immunitaire combiné sévère) ADA WAS Maladies neurologiques ou dégénératives Maladie de Huntington, ataxie de Friedrich… Maladies de la peau : épidermolyse bulleuse Maladies du sang Hémophilie Thalassémie Drépanocytose…. Maladies de la vision …..

Stratégies de transfert de gènes. Sélectionner un gène d’intérêt Choisir un vecteur efficace de transfert selon les séquences à transférer Transfert ciblé Gène patient

Principe de la thérapie génique

Vecteur idéal Protection du gène Transfert aux cellules Absence de toxicité Absence de caractère immunogène Production aisée

Les vecteurs

Vecteur viral idéal Production facile et reproductible Concentration importante Absence de pathogénicité liée à une potentielle insertion du vecteur Absence d’induction d’une réponse immunitaire neutralisante Ciblage par le virus de l’organe et/ou de la cellule adéquats. Obtenir une expression efficace du gène d’intérêt L’intégration est idéale pour une expression stable et une transmission aux cellules filles

Les vecteurs viraux Cycle viral naturel Production de virus recombinants infection encapsidation du gène thérapeutique réplication transduction Immunogénicité Intégration au génome (risque de mutagenèse) Spécificité d’expression : restriction d’expression au tissu ciblé par le vecteur

Principes des vecteurs non réplicatifs Virus défectifs Un ou plusieurs gènes essentiels à la réplication sont délétés afin de rendre les virus incompétents pour toute réplication dans l’hôte. «  Packaging cell line » Une lignée cellulaire exprimant les gènes essentiels délétés dans le vecteur est construite afin de produire les vecteurs viraux. Séquences essentielles aux vecteurs Séquence  : séquence d ’encapsidation du vecteur recombinant Séquence poly A : séquence permettant la stabilisation des ARNm Séquences promotrices : Promoteur adapté en amont du TG Transgène

Les Adénovirus - Virus non enveloppés Génome = double brin ADN linéaires de 36 kb Insertion d’un transgène de 30 kb possible (2nde et 3ème génération) Transduit cellules quiescentes ou en prolifération Tropisme large (récepteur aux intégrines v5 v3) Pas d’intégration dans le génome : expression du transgène transitoire et faible Pas à la correction à long terme d’une maladie chronique Destinés - à la destruction ciblée de cellules - à l’immunothérapie - aux maladies aiguës

Organisation génétique des Adénovirus E1A : transactivation et entrée en phase S E1B : fonction anti-apoptotique E2 : réplication du DNA E3 : contrecarre les défenses innées E4 : régule le processing et l’export des ARNm tardifs IVa2 : transactivation du promoteur tardif

Générations de vecteurs adénoviraux Particularité des protéines E1 et E3 : E1 transactive l ’expression des gènes viraux et transforme les cellules E3 une protéine non essentielle qui contrecarre les défenses de l’hôte anti-adénovirus  la délétion de E1 et E3 libère 7kb pour insérer un transgène

Formation de virus recombinants Séquences de recombinaison homologue (E2) Transfection Recombinaison homologue Noyau MCS Transgène Cellules 293 (expriment E1) Adénovirus recombinant ITR Poly A  Promoteur Génome viral 3’ 

Infection par les Adénovirus

Application à la thérapie génique

Avantages et limitations des vecteurs adénoviraux Tropisme pour des récepteurs largement exprimés (sauf lignées lymphoïdes) Pas de réplication autonome et production minimum de protéines virales chez l’hôte Survie des cellules infectées Choix de promoteurs, niveau d’expression élevé Production de hauts titres infectieux Vecteur transduisant des cellules quiescentes « Packaging cell lines » : les cellules 293 expriment les protéines E1 Inconvénients Pas de choix possible des récepteurs La réponse immunitaire reste un obstacle majeur (80% de la population est séropositive) L ’ADN ne s ’intègre pas (épisome)  persistance limitée dans le temps du DNA (2 semaines) Insert de petite taille (max 7 kb) Risque de recombinaison théorique avec des infections endogènes

Les AAVr Parvovirus de petite taille (20-25 nm), non enveloppé ADN monocaténaire linéaire (5 kb) Transduction des cellules quiescentes ou en prolifération S’intègre dans le génome au niveau d’une région spécifique (K19) Incapable de se répliquer seul : nécessite une co-infection avec un adénovirus ou un herpès virus Administration à l’origine d’une réponse humorale forte Expression du transgène lente AAVr permet l’expression à long terme de transgènes de petite taille

Formation de virus recombinants Particularité des vecteurs adéno-associés : Tous les gènes viraux sont délétés Les « packaging cell lines » sont complémentés pour les protéines virales et helper Transfection Noyau MCS Transgène Cellules 293 (expriment E1) Virus adéno-associé recombinant ITR  Promoteur Gènes rep Gènes cap  Poly A Plasmide E2 et E4 adénovirus 

Cycle réplicatif L ’entrée dans la cellule par endocytose, via les héparines sulfates et récepteurs secondaires (avb5, FGF) (large spectre de cellules infectées) -Adressage de l ’ADN au noyau -Transcription en ADN double-brin (nécessite un virus helper du type adéno (E4), herpes), Intégration -Expression des ARNm (facilitée par les virus  helper ) -La production de particules virales (très résistantes : pH, température, détergents)

Avantages et limitations des vecteurs adéno-associés Tropisme pour un récepteur largement exprimé Pas de réplication autonome et absence de production de protéines virales par l’hôte Survie des cellules infectées Production de hauts titres infectieux L ’ADN s ’intègre dans le chromosome 19  persistance de l ’expression  intégration aléatoire limitée Réponse immunitaire très faible Les vecteurs transduisent des cellules quiescentes Inconvénients Pas de choix possible des récepteurs Insert de petite taille « Packaging cell lines » : expriment rep, cap (adéno-associées) E1, E3 et E4 (adénovirus)

Les rétrovirus Particularités des rétrovirus Leur génome est un ARN de taille réduite (10kb)  limitation de la taille des inserts Ils intègrent leur matériel génétique de manière aléatoire  risque de transformation Virus enveloppés  pseudotype VSV env (ou autre protéines d ’enveloppe) Ils infectent largement les cellules mammifères Les lentivirus infectent les cellules quiescentes

Les rétrovirus : cycle de réplication LTR  pol env gag Fixation et entrée Bourgeonnement Décapsidation Rétrotranscription Intégration Transport au noyau

Principe de fonctionnement des vecteurs rétroviraux (1)

Principe de fonctionnement des vecteurs rétroviraux (2) LTR Transgène 

Principe de fonctionnement des vecteurs rétroviraux (3)

Les vecteurs lentiviraux (HIV)

Avantages et limitations des vecteurs rétroviraux et lentiviraux Tropisme : large choix de protéines d ’enveloppe Pas de réplication autonome et production minimum de protéines virales chez l’hôte Réponse immunitaire très limitée Intégration aléatoire et persistance du DNA rétrotranscrit (sauf méthylation des promoteurs) Survie des cellules infectées Grand choix de promoteurs possibles Risque de recombinaison limité par le fractionnement des constructions Les vecteurs lentiviraux transduisent des cellules quiescentes Inconvénients Production difficile de hauts titres infectieux Intégration aléatoire, risque pathogène Insert de petite taille (max 10 kb) « Packaging cell lines » : constructions complexes exprimant gag, pol et env Les vecteurs rétroviraux classiques ne transduisent pas les cellules quiescentes

Les vecteurs non viraux Production aisée Absence de pathogénicité et d’immunogénicité Injections répétées possibles Flexibilité de la taille du transgène ADN nu : Plasmide bactérien Rapidement dégradé par les nucléases endogènes Lipides et polymères :

Transfert d’ADN par les liposomes

Vecteur Avantages Inconvénients Adénovirus AAV Rétrovirus Lentivirus Fort taux de transduction in-vivo et ex-vivo Cellules quiescentes et en division Production aisée Taille limite du transgène 7,5 kb Réadministration impossible Durée d’exposition courte AAV Durée d’expo longue in-vivo Peu immunogène Taille limite du gène 4,5 kb Production moyenne Rétrovirus Taux de transduction élevé ex-vivo Durée d’exposition assez longue Taux de transduc. faible in-vivo Cellules en division, risque mutation insertionnelle Taille limite du gène 8 kb Production difficile Lentivirus Affilié aux virus immuno-dépresseurs, prod difficile Taille limite du gène ADN nu Sécurité d’emploi, peu immunogène Production simple Transfection très peu efficace Durée d’expression très courte Lipides cationique Transfection efficace in-vivo (non ionique) Peu immunogène Production assez simple Tranfection inefficace in-vivo (cationique), durée d’expression très courte, Toxicité

Un exemple de thérapie génique chez l’homme Maladie monogénique Affected cells Gene product Disease Relative frequencyb% T, B, NK, myeloid cells, platelets Reticular dysgenesis 4 AR Unknown Alymphocytosis 15 AR T, B RAG-1, RAG-2 15 T, B Artemis AR Absence of T lymphocytes and NK 40 X-L T, NK γc chain 10 AR T, NK JAK-3 Absence of T lymphocytes 5 AR T IL-7 Rα chain ≤1 AR T CD45 ≤1 T AR CD3δ ADA deficiency 10–15 AR T, B, NK ADA aAbbreviations: ADA, adenosine deaminase; AR, autosomal recessive; NK, natural killer cells; X-L, X-linked recessive. Clinique : infection rapide système respiratoire et digestif

Traitements conventionnels : transplantation allogénique Pas de rejet des cellules transplantées Perte des progéniteurs en 10 ans Réversion spontanée Restauration d’une séquence sauvage ou moins délétère Thérapie génique

Bases de l’étude Construction : c est exprimé de façon ubiquitaire dans les lignées hématopoïétiques c transcrit de façon continue dans les lymphocytes L’expression et la fonction de c entraînent des signaux de survie et de prolifération Construction :

Résultats Cliniques 1er essai clinique incluant 10 enfants de moins d’1 an Patient Follow-up γc Immunitya Clinical statusb (years) Expression T B 1 5.2 3+ 2+ AW 2 5.1 3 (0.7) + − A (BMT) 4 4.6 A, lymphoprol. synd., BMT 5 4.4 AW, lymphoprol. synd., CR 6 3.0 7 2.9 8 2.5 9 2.3 10 2.0 +/– – A Étude entre 1999 et 2002 sur 10 enfants de – d’1 an A : alive ; AW : alive and well ; BMT : bone marrow transplantation ; CR : complete remission Lymphoprol. Synd. : lymphoproliferative syndrome

Bénéfique pour la plupart des patients traités 50 à 100 sites d’insertion du provirus détecté dans les cellules T Transfert du gène c bien moins efficace pour réguler la déficience en cellules NK Faible pourcentage de cellules B transduites (1%) Bénéfique pour la plupart des patients traités

Bilan de l’essai Des améliorations sont nécessaires : Utiliser des vecteurs lentiviraux Limitations : Echec chez un enfant ayant une splénomégalie massive Liée à l’âge 2 syndromes lymphoprolifératifs

Thérapie génique et cellulaire du diabète

Le diabète Type 1 : Type 2 : Maladie auto-immune du sujet jeune Destruction des îlots de Langerhans Insulinothérapie à vie Type 2 : Maladie du sujet plus âgé classiquement en surpoids Association insulino-résistance et carence relative en insuline Règles hygiéno-diététiques, antidiabétiques oraux puis insulinothérapie

La greffe d’îlots pancréatiques Résultats médiocres jusqu’en 2000 2000 : protocole sans corticoïdes 80% d’insulino indépendance à 1 an 65% à 3 ans 10 % à 5 ans Limites : nombre de pancréas disponibles Transplantation allogénique problématique Potentiel des cellules ES ou tissus des fœtaux pour générer des cellules  ou des îlots Éventuels précurseurs endocrines dans le pancréas adulte ?

Thérapie génique du diabète Constructions contenant la région codante de la proinsuline ou une séquence modifiée Délivrance in-vitro ou in-vivo Les cellules  générées doivent synthétiser, maturer, empaqueter et stocker l’insuline Permettre une activation et une répression rapide de la sécrétion d’insuline

Facteur pro-endocrine utilisé dans les thérapies génique et cellulaires du diabète : PDX-1 Utilisation de vecteurs adénoviraux Expression dans le foie de souris → active le gène de la proinsuline endogène → augmentation du niveau d’insuline Transduction d’hépatocytes humains ex-vivo Ferber et al Nature , 2000

Thérapie génique Méthode : analogue de l’insuline inséré dans un adénovirus ADV dans veine porte de l’animal Résultats : Contrôle glycémique Expression de l’analogue dans le foie Lee et al Nature 2000

Thérapie génique Construction d’un transgène contenant la préproinsuline et un promoteur spécifique des cellules K Génération de souris transgéniques avec cette construction Expression dans les cellules K : régulation positive par prise alimentaire Injection de STZ aux souris transgéniques Résultats Production d’insuline par les cellules K Tolérance glycémique normale Cheung et al, science 2000

Gene therapy for diabetes: which tissue or cell type is best? (1) Cellules/tissu Caractéristiques permettant une thérapie génique Inconvénients possibles Foie disponibilité vecteurs avec fort tropisme hépatique Favorables pour la transplantation d’îlots Situé en aval du flux de nutriments et les cellules « senseur » de glucose Transdifférentiation possible entre foie et cellules endocrines Plasticité pour une différenciation vers les cellules endocrines Potentiel pour thérapie génique ex-vivo avec hépatocytes adultes ou fœtaux pourrait affecter les fonctions hépatiques Effet hyperplasique ou néoplasique potentiel Pancréas Localisation anatomique classique de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose Injection directe permettrait une transduction primaire des cellules pancréatiques avec vecteurs adéno ou AAV Contient des cellules dans les compartiments endocrines et exocrines capables de différenciation pro-endocrine ex-vivo -induction de pancréatite par les vecteurs Établissement pancréatique difficile in-vivo Intestin Exposé aux aliments ingérés PDX-1 a un rôle connu dans la différenciation anthéroendocrine Les cellules intestinales embryonnaires synthétisent l’insuline en réponse à des facteurs pro-endocrines (PDX-1, Isl-1) PDX-1 stimule la synthèse de produits anthéroendocrines Délivrance in-vivo ? Turn-over rapide des anthérocytes

Gene therapy for diabetes: which tissue or cell type is best? (2) Moelle osseuse Contient des progéniteurs multipotents adultes capables de se différencier en cellules endocrines Thérapie génique ex-vivo possible Les cellules dérivées de moelle osseuse produisent de l’insuline sous certaines conditions de culture -Les cellules transdifférenciées peuvent retournée vers la moelle osseuse -Peuvent être impliquées dans des processus pathologiques dans d’autres tissus Cellules souches - Cellules pluripotentes capables de subir une différenciation pro-endocrine permettant une thérapie génique ou cellulaire ex-vivo problème éthique Potentiel oncogène in-vivo

Thérapie génique du diabète de type 2 2 essai de thérapie génique chez la souris : Rôle prédominant de la glucokinase (GK) dans l’homéostasie du glucose au niveau du foie et des cellules β Activité de la GK hépatique contrôlée par la « GK regulatory protein » (GKRP). Utilisation d’adéno exprimant hGKRP dans des souris diabétiques Augmentation de la tolérance au glucose Diminution du niveau d’insuline Diminution du poids corporel

Thérapie génique du diabète de type 2 PI3K et effecteur (PKCζ, PKCλ) impliqués dans le transport de glucose stimulé par l’insuline dans les adipocytes Transduction d’adipocytes 3T3L1 avec adéno exprimant PKCλ Stimulation par l’insuline de la captation de glucose Transduction de cellules musculaires squelettiques avec adéno exprimant hPKCζ Stimule le transport de glucose

Thérapie génique Limites : Reproductibilité à l’homme ? Défaut de régulation : régulation génique moins fine que celle obtenue en physiologie

Différenciation de tissus immatures Thérapie Cellulaire Différenciation de tissus immatures

Sources de cellules β

Différenciation de tissus immatures

Cellules ES : Différenciation spontanée en cellules produisant de l’insuline Soria Diabetes 2000

Cellules ES : Différenciation spontanée en cellules produisant de l’insuline Culture de cellules ES humaines Différenciation en « corps embryoïdes » Expression spontanée d’insuline dans les corps embryoïdes et les cellules cultivées à haute densité Assady diabetes 2000 Culture de cellules ES murines en haut glucose Cascade spontanée des différents facteurs de transcription nécessaires à la différenciation pancréatique Kahan Diabetes 2003

Cellules ES : Différenciation forcée en cellules produisant de l’insuline

Cellules ES : Différenciation forcée en cellules produisant de l’insuline

Thérapie cellulaire du diabète Obtention de cellules produisant : insuline, glucagon, somatostatine, polypeptides pancréatiques et ghreline Pas de sécrétion d’insuline en réponse au glucose Optimisations nécessaires Cellules  matures pouvant être transplantées. Effet de la transplantation ?? (D’amour K and al. Nature Biotech 06)

Cellules ES : Différenciation en cellules produisant de l’insuline Peu reproductible Faible rendement Nombreuses étapes fines de développement Barrières éthiques ?

Greffe de pancréas embryonnaire humain chez souris Différenciation de tissu immature : cellules fœtales ayant déjà initié leur différenciation en cellules pancréatiques In vivo Greffe de pancréas embryonnaire humain chez souris Observation : Du développement De la différenciation De la fonctionnalité des cellules endocrines

Différenciation des précurseurs pancréatiques fœtaux in vitro Récupération des cellules pancréatiques fœtales Mise en culture Action de différents facteurs de croissance : étude de leur prolifération et de leur différenciation Scharfmann, Diabetes 2001

Différenciation des précurseurs pancréatiques fœtaux in vitro

Différenciation des précurseurs pancréatiques fœtaux in vitro

Différenciation des précurseurs pancréatiques fœtaux in vitro

Différenciation de tissus adultes et transdifférentiation Thérapie Cellulaire Différenciation de tissus adultes et transdifférentiation

Balance entre les facteurs accélérants et inhibant l’expansion et la diff des ç souches adultes impliquées dans la régénération pancréatique

Progéniteurs adultes : rationnel Différenciation de précurseurs pancréatiques adultes : au sein du pancréas, les cellules canalaires Progéniteurs adultes : rationnel Pancréatectomie subtotale : régénération d’îlots Modèles de ligature canalaire : bourgeonnement de cellules à partir de canaux ligaturés (production d’insuline) Au sein des cellules canalaires Purification de cellules canalaires Obtention de « bourgeons » Régénération de cellules insulino-sécrétrices à partir de cellules pancréatiques canalaires Bonner Weir PNAS 2000

Régénération de cellules insulino-sécrétrices à partir de cellules pancréatiques canalaires Bonner Weir PNAS 2000

Régénération de cellules insulino-sécrétrices à partir de cellules pancréatiques canalaires Bonner Weir PNAS 2000

Progéniteurs adultes au sein de cellules canalaires Culture de cellules canalaires murines Bourgeonnement de IPC (Islet Progenitor Cell) (Insuline et glucagon) Différenciation Réponse insulinique lors de stimulation par le glucose in vitro et in vivo Normalisation glycémique des souris STZ avec néovascularisation Ramiya Nat Med 2000

Progéniteurs adultes au sein de cellules canalaires Ramiya Nat Med 2000

Progéniteurs adultes au sein de cellules canalaires Encore à l’heure actuelle des études (marquages) sont faites pour essayer de reperer (identifier) des progéniteurs adultes Ramiya Nat Med 2000

Les progéniteurs adultes au sein du pancréas - îlots Régénération de cellules insulino-sécrétrices à partir d’îlots de Langerhans de rat et humain Ajout de facteurs de croissance Différents protocoles de différenciation Zulewski Diabetes 2001

Les progéniteurs adultes au sein du pancréas - îlots Régénération de cellules insulino-sécrétrices à partir d’îlots Zulewski Diabetes 2001

Les progéniteurs adultes au sein du pancréas - îlots Zulewski Diabetes 2001

Progéniteurs adultes : limites Identification précise controversée (Nestine) Séparation tissulaire fiable ? Contamination endocrine / exocrine

Transdifférenciation Production d’une cellule différenciée à partir d’une cellule d’un phénotype différent Transdifférenciation à partir de cellules hépatiques Yang PNAS 2002

Transdifférenciation cellulaire à partir de cellules mésenchymateuses

Transdifférenciation cellulaire à partir de cellules mésenchymateuses Ianus JCI 2003

Transdifférenciation cellulaire à partir de cellules mésenchymateuses Migration de cellules hématopoïétiques dans les îlots de Langerhans Ianus JCI 2003

Transdifférenciation cellulaire : limites Le matériel à différencier : disponibilité des cellules ovales ? Cellules issues de moelle osseuse : très prometteur À confirmer / Clarifier

Problèmes potentiels Rejet de greffe dû à l’immunité Formation de tumeurs Site d’implantation Survie de l’implant Sécurité biologique du mécanisme

Conclusion De nouvelles perspectives apparaissent dans le traitement du diabètes : Progrès dans la réalisation de greffe d’îlots pancréatiques Nouvelles sources de cellules souches pancréatiques La guérison du diabètes = une utopie ou une question de temps ??