Examen bactériologique des hémocultures Charlotte Guyon Anne Legrand DES bactériologie Avril 2011

Généralités Sang = milieu stérile Présence de Bactérie(s) = bactériémie Champignon(s) = fongémie Bactériémie/fongémie physiologique Digestion, brossage des dents (transitoire) Clinique : différents niveaux de gravité Rarement asymptomatique Associée à un Syndrome de Réponse Inflammatoire Systémique (SRIS) = sepsis Associée à un sepsis sévère Associée à un choc septique +/- sd de défaillance multi viscérale

Généralités Critères cliniques de gravité

Diagnostiquer une bactériémie Clinique Sd infectieux : fièvre, frissons, foyer infectieux spécifique Signes de sepsis sévère ou de choc septique Facteur favorisant ? Immunodépression Diabète Grossesse Porte d’entrée? Matériel étranger Existence d’un autre foyer infectieux Confirmation biologique : hémocultures Hépatopathie Toxicomanie IV, alcoolisme Matériel étranger et/ou prothétique

Indications Toute fièvre d’origine indéterminée (>38,5°) Isolée (femme enceinte, immuno-déprimé) Associée à des signes cliniques évocateurs d’infection, de sepsis sévère ou de choc septique Associée à la présence d’un foyer infectieux spécifique : EI, pyélonéphrite, ….

Objectifs Rechercher une cause bactérienne, responsable de la clinique Isoler et identifier dans le sang la bactérie responsable Antibiogramme si nécessaire Rechercher et préciser l’étiologie d’une endocardite infectieuse Orienter la recherche d’un foyer infectieux indéterminé Documenter l’implication d’un dispositif intra vasculaire dans un état septique

Démarche diagnostique Prélèvement Transport Incubation Détection de la croissance Examen bactériologique Rendu des résultats

Prélèvement : modalités Protocole validé par le CLIN : règles d’hygiène et antisepsie rigoureuses But = éviter la contamination du prélèvement, réduire les AES CCLIN sud-est, CHU de Lyon

Conditions de prélèvement Porte de chambre fermée Port d’un masque chirurgical Lavage/désinfection des mains du préleveur Port de gants non stériles Désinfection de l’opercule des flacons et du point de ponction avec un produit approprié Ne plus palper la veine après cette étape Prélever le sang en contrôlant le bon remplissage des flacons Identifier correctement l’ensemble des flacons Recommandé d’utiliser des antiseptiques alcooliques

Sites de prélèvement Ponction veineuse Seule méthode valable pour prélever le sang en vue d’une culture bactériologique Prélèvement via dispositif intra-vasculaire (DIV) Présence fréquente de contaminants Seul intérêt = déterminer la responsabilité du DIV dans une bactériémie Prélèvement simultané d’hémocultures sur DIV et en périphérie = hémocultures appariées ou quantitatives En pratique le prélèvement via la VVC est souvent utilisée afin d’éviter la multiplication des prélèvements chez un patient.

Moment du prélèvement Au pic fébrile À distance de l’administration d’antibiotiques À la vallée Fenêtre thérapeutique de 48-72h Endocardite infectieuse Prélèvement de 3 hémocultures espacées d’1 heure minimum avant toute prise d’ATB Pas

Volumes prélevés Importance +++ car corrélée au rendement de la technique, donc à la sensibilité Adulte Densité bactérienne # 1 UFC/ mL sang Paires d’hémocultures : flacon aérobie + anaérobie Volume optimal = 40 à 60 mL soit 2 à 3 paires d’hémocultures par 24 h (volume minimal = 20 mL) Enfant Concentration bactérienne plus élevée, diminuant avec l’âge 1 seul flacon pédiatrique Volume à adapter en fonction du poids A partir de 36kg il faut 10 ml commeladulte

Facteur de dilution But = diluer les substances inhibitrices présentes dans le sang (complément, lysozyme, cellules phagocytaires, antibiotiques) Ratio sang/bouillon Systèmes manuels : 1/5 à 1/10 (vol/vol) Systèmes automatisés : 1/2,5 à 1/5 Intérêt des flacons pédiatriques (ratio sang-bouillon adapté au volume de sang prélevé) non démontré

Nombre de prélèvements Intervalle entre 2 prélèvements Nul ou intervalle de quelques heures, à chaque pic fébrile Pas d’influence sur les performances diagnostiques Prélèvements multiples vs prélèvement unique Même sensibilité Intervalle na pas dimportance qualité du diagnostic equivalente

Comparaison des protocoles de prélèvement d’hémocultures Prélèvements multiples 2 à 3 prélèvements de 2 flacons Prélèvement unique 1 seul prélèvement de 4 à 6 flacons Nb de prélèvements 2 à 3 1 Nb total de flacons mis en culture 4 à 6 4 à6 Sensibilité Sensibilité équivalente Détection équivalente des bactériémies lorsque les prélèvements sont espacés dans le temps ou réalisés simultanément Taux de contamination Modéré Faible (divisé par 2 à 3) Interprétation du résultat (reconnaissance des contaminants) Interprétation sur la base de l’espèce isolée et du nb de prélèvements positifs Confrontation clinico-biologique Interprétation inutile pour la plupart des contextes cliniques Remarques Malgré des règles d’interprétation, conclusion délicate en cas de bactériémie liées à un dispositif intra-vasculaire Non conseillé pour les endocardites infectieuses et pour les infections liées à un dispositif intra-vasculaire Avantages Plus simple (un seul prélèvement) Antibiothérapie instaurée plus rapidement

Choix des conditions de culture Richesse du milieu liquide : Trypticase-soja, bouillon cœur-cervelle, peptones, supplémentés en nutriments et facteurs de croissance, milieux spécifiques levures Atmosphère aérobie (O2 et CO2) et anaérobie (CO2 et H2 ou N2)  fréquence d’isolement des bactéries anaérobies strictes Remise en cause du flacon anaérobie MAIS : facilite la croissance de certains germes (streptocoques, entérocoques,…) Important dans les infections gynécologiques et digestives

Choix des conditions de culture Anticoagulant : polyéthanol sulfonate de Na (SPS) Inhibe l’activité bactéricide du sérum, la phagocytose cellulaire, l’activité du complément et du lysozyme Inhibe l’activité de certains antibiotiques MAIS risque d’inhibition de certaines souches de Neisseria, Peptostreptococcus anaerobius, Capnocytophaga, Gardnerella… Produits adsorbants Résine adsorbante de cations ou charbon activé Propriétés mal connues : effet neutralisant des antibiotiques et des substances toxiques ++ pour la détection de S. aureus et des Entérobactéries MAIS pas pour les bactéries non fermentantes ni les levures Prélèvements de préférence à la vallée

Types de flacons disponibles Flacons pour systèmes manuels avec ou sans indicateur de croissance (mise en évidence d’une surpression) Systèmes biphasiques : milieu liquide + gélose : observation d’un trouble ou de colonies sur la gélose Système Isolator® : bactéries intracellulaires et mycobactéries, levures et filamenteux  lyse des cellules sanguines (saponine), inhibition phagocytose et activité bactéricide du Se, centrifugation, mise en culture du culot Intérêt : - concentration des bactéries dans le lysat, - performant MAIS: Risque de contamination +++ et couteux

Types de flacons disponibles Flacons pour systèmes automatisés Mise en évidence de la croissance bactérienne grâce à un indicateur coloré Flacons Bact Alert® Flacons Bactec®

Transport Acheminement le plus rapidement possible au laboratoire En cas de délai Incubation manuelle: à l’étuve à 35°C le plus rapidement possible Incubation dans un automate: maintien à T° ambiante avant l’introduction dans l’automate  Eviter le risque de faux négatifs ou une augmentation du délai de positivité

Incubation Incubation à l’étuve/dans un automate Durée d’incubation 7 jours à l’étuve ou 5 jours avec les systèmes automatisés Bactéries détectées au-delà = souvent contaminants Délai prolongé pour les microorganismes à croissance lente (HACCEK, Brucella spp, champignons…) n’est pas nécessaire avec les automates Incubation à 35°C

Détection de la croissance bactérienne Systèmes manuels Flacons inspectés quotidiennement Recherche d’un trouble provoqué par la croissance bactérienne, de la production de gaz, d’un coagulum… Bactéries troublant peu le milieu le bouillon de culture Brucella spp, Haemophilus spp, Neisseria spp, campylobacter spp La croissance bactérienne crée un dégagement gazeux et qui provoque une surpression dans le flacon. Le mélange sang/bouillon se déplace alors à travers l’aiguille dans l’indicateur 22

Détection de la croissance bactérienne Systèmes automatisés à détection continue Amélioration de la détection de la croissance bactérienne : plus sensible et plus rapide (agitation)  lecture toutes les 10 min Principe = détecteur de CO2 au fond du flacon contenant un indicateur de pH, séparé du bouillon par une membrane ½ perméable au CO2 CO2 =  pH (indicateur coloré) mesurée par réflectométrie (BacT ALERT) ou fluorimétrie (Bactec) Algorithme tenant compte Flacons déclarés positifs selon un algorithme de mesure: - concentration initiale en CO2 de la vitesse de production de CO2 de l’ de la vitesse de production de CO2 23

Détection de la croissance bactérienne Bactec® BacT ALERT ®

Examen bactériologique : Recommandations REMIC ED : lame-lamelle + Gram  Bactériémie: diagnostic d’urgence Appel des résultats des ED Milieux ensemencés au minimum: Milieux supplémentés en sang Atmosphères aérobie, anaérobie et sous CO2 Adaptation selon le résultat de l’ED et le contexte clinique Recherches spécifiques Mycobactéries Micro-organismes non cultivables en flacon d’hémoculture (Bartonella, Leptospira, Legionella, Coxiella) Levures et moisissures

Levures et moisissures Hémoculture = examen clé dans le diagnostic des mycoses invasives Responsabilités dans les infections nosocomiales et communautaires de + en + démontrée Candida++ Facteurs de risques : ID, utilisation d’AB à large spectre, cathéter Les automates et l’optimisation des milieux de cultures (flacon aérobie) ont amélioré la rapidité d’isolement des champignon Flacons négatifs dans 50% des infections fongiques disséminées Utilisation de flacon spécifique intéressante Paramètres : T° optimale de culture : 37°C (levures) 27-30°C (ch.filamenteux), Privilégier l’aérobiose Incubation 5-7jrs (levures), 3 à 6 semaines (ch. dimorphiques)

Interprétation Éléments pris en compte Critères de pathogénicité Nombre d’hémocultures positives Différentes situations en faveur d’une étiologie bactérienne Plusieurs hémocultures positives avec un même germe Plusieurs hémocultures positives avec germes différents sur terrains particuliers : cirrhose hépatique, dysimmunité, foyer digestif ou cutané Dès la première hémoculture si bactérie pathogène spécifique : S. aureus, S. pneumoniae, entérobactéries, P. aeruginosa, Haemophilus spp, N. meningitidis, Listeria, Campylobacter spp, HACCEK, levure, … Contamination probable si une seule hémoculture avec bactérie de la flore cutanéo-muqueuse (SCN, Corynebacterium spp, Bacillus spp, P. acnes) 27

Fréquence des espèces bactériennes et signification clinique Espèces les plus fréquemment isolées SCN (majo = contaminants, 10-30% ont une signification clinique) Staphylococcus aureus Escherichia coli Espèces en augmentation Enterococcus spp Levures Espèces anaérobies: très faible (<3%)

Nature des bactéries identifiées et signification clinique Germes quasiment tjs pathogènes S. aureus, E. coli, Entérobactéries, P. aeruginosa, C. albicans Germes fréquemment contaminants Bacillus spp, Corynebacterium spp, Propionibacterium spp Interprétation difficile S. viridans, Enterococcus spp, SCN Isolement d’une de ces espèces → rechercher l’absence de DIV compatible avec une endocardite infectieuse avant de conclure à un contaminant

Signification de positivité d’un ou plusieurs flacons Nature du µ-organisme isolé ou identifié Nb de flacons positifs Nb total d’hémoc réalisées Renseignements cliniques Conduite à tenir SCN P. acnes, S. « viridans » Bacillus spp 1 ou 2 d’une même paire ≥ 2 Pas d’orientation clinique Conta probable Service d’oncohémato, réa, cathéter central, infection associée aux soins Ident + ATB avec la mention « à interpréter en fonction de la clinique et du prélèvement 1 Quel que soit le contexte 2 ou 3 de deux paires différentes Ident + ATB sans restriction

Signification de positivité d’un ou plusieurs flacons Nature du µ-organisme isolé ou identifié Nb de flacons positifs Nb total d’hémoc réalisées Renseignements cliniques Conduite à tenir S. aureus S.pneumoniae Strepto β-hémolytique Enterococcus spp Entérobactéries P. aeruginosa C.albicans Anaérobies N.meningitidis Haemophilus spp HACCEK Brucella spp Pasteurella spp Campylobacter spp ≥ 1 Quel que soit le nombre total Quel que soit le contexte Ident + ATB sans restriction

Cas particuliers Hémocultures polymicrobiennes Faux positifs 10% des hémocultures pédiatriques 30% des hémoc chez immuno-déprimés Interprétation: toutes les espèces ont le même potentiel infectieux Faux positifs Grande quantité de leucocytes Flacons trop remplis Flacons oxygénés Faux négatifs Délai avant l’introduction dans le Bact-Alert

Interprétation des hémocultures appariées Concept : 2 approches Qualitative : délai différentiel de pousse (>2h) Quantitative concentration bactérienne dans sang prélevé sur DIV concentration bactérienne dans sang prélevé en périphérie > Signe la responsabilité du DIV dans la bactériémie 33

Hémocultures appariées quantitatives Modalités Prélèvement sur 2 tubes Isolator® pédiatrique de 1,5mL de sang Kit de prélèvement CHLS Ensemencement immédiat : GS pur et GS après dilution au 1/10 en bouillon Retrait du matériel inutile dans 85% des cas, kit KT= maintien du matériel Existence d’un etat septique apres colo du cathéter 34

Hémocultures appariées quantitatives Interprétation : lecture à 24, 48 et 72h Objectifs : comparer les dénombrements des µ-org isolés dans les tubes « cathéter » et « veineux » Si plusieurs espèces bactériennes : dénombrement, identification et ATB pour chaque espèce Détermination d’une différence significative Abaque si <55 UFC/mL Si > 55UFC/mL : différence significative si le nb d’UFC/mL d’un des tubes est > à 3 fois celui de l’autre Remplace pas une hémoc car moins sensible car moins de volume et on rate les anaér 35

Hémocultures appariées quantitatives Réponses :  Nb UFC/mL « cathéter » > nb UFC/mL « veineux » = cathéter sans doute à l’origine de la bactériémie  Nb UFC/mL « veineux » > nb UFC/mL « cathéter » = cathéter à priori non responsable de la bactériémie  Nb UFC/mL « cathéter » > nb UFC/mL « veineux » stérile = cathéter colonisé

Comparaison inter-sites 37

Comparaison intersites Types de flacons utilisés CBS CBN CBPE Flacons aérobies TS TS + CC + charbon activé Flacons anaérobies Flacons pédiatriques / TS + CC + charbon activé, aé Flacons particuliers Isolator® + flacons mycobactéries Au CBE, le charbon est dans les flacons anaérobie pour ne pas gêner la détection des levures qui ne poussent qu’en aérobie. Les levures sont fréquentes au CBPE. Justification du choix CBPE : Fl aé sans charbon pour pouvoir voir les levures à l’ED CBN : Fl anaé sans charbon pour bien voir les germes d’identification difficile TS = trypticase-soja, CC = cœur-cervelle

Comparaison intersites Incubateurs automatiques : Bactalert® Comparaison des durées d’incubation CBS CBN CBPE Remic Cas standard 5 j 7 j 6 j 5 j automate 7 j étuve Cas particulier Mycobactéries : 42 j Brucella, Listeria, Levures, HACCEK, EI : 10 j EI : 10 j Incubation prolongée: plus d’intérêt avec les automates Transfere le tube isolator ds flacon mycobacterie Hémoculture détectée positive Lame-lamelle : mobilité Gram

Milieux ensemencés ED CBS CBN CBPE Remic négatif GS CO2 COS anaé Gél Choc + PVX CO2 GS µaé GS aé GS anaé si fl anaé GS, aérobie Choc+PVX, CO2 B Schaedler + vit K3 Milieux supplémentés en sg, aérobie, anaérobie, sous CO2, adaptés selon la morphologie de la bactérie et le contexte clinique C+ amas GS CO2 TS inclinée BCC→coagulase C+ chaînette GS + opto GS + optochine, aé COS, CO2 Gél Choc+PVX, CO2 BCC C- GS aérobie

Milieux ensemencés ED CBS CBN CBPE Remic B- type EB ou Pseudomonas Mobilité? Gaz? GS CO2 COS anaé Gél Choc + PVX CO2 URI4 GS aé GS anaé si fl anaé GS, aérobiose Gél ID polyvalente = uri4 BCC Milieux supplémentés en sg, aérobie, anaérobie, sous CO2, adaptés selon la morphologie de la bactérie et le contexte clinique B- petits, fins polymorphes type anaé, HACCEK, Brucella Sauf si B- incurvé à l’ED : GS µaé Si suspicion Campylo : Karmali µaé GS aérobiose Gél Choc+PVX, CO2 Schaedler anaérobie B Schaedler + vit K3 Si suspicion Campylo à l’ED : COS µaé Pas de gelose en partic si BGN

Milieux ensemencés ED CBS CBN CBPE Remic B+ Clostridium,Bacillus Lacto, Leptotrichia Propioni, Coryne Listeria GS CO2 COS anaé Gél Choc + PVX CO2 Esculine GS aé GS anaé si fl anaé GS aérobie Gél Choc+PVX CO2 Schaedler, anaérobie BCC Bouillon Schaedler BCP (Bacillus) BCC + esculine (Listeria) Milieux supplémentés en sg, aérobie, anaérobie, sous CO2, adaptés selon la morphologie de la bactérie et le contexte clinique Levures, éléments mycéliens Chromogène levure Gél Sabouraud Sabouraud pente

Conditions d’incubation CBS CBN CBPE Remic Température standard Standard : 35° Standard : 37° 35° Aucune indication Températures particulières Levures : 30° BGN non fermentants et Levures : 30° Ø Durée standard 48h Durées particulières Levures : 5j Campylo : 5j Levures : 3-5j inutile

Identification - Antibiogramme CBS CBN CBPE Remic Identification Toute hémoc+ sauf SCN et BGP (≥ 2 hémocs+) Toute hémoc+ sauf SCN (≥ 2 hémocs+) Cf tableau Antibiogramme Systématique si pathogène reconnu ≥ 2 hémocs+ si contaminant potentiel : SCN, Neisseria (sauf meningo et gono), BGP (sauf Listeria) ≥ 2 hémocs+ si contaminants : SCN Systématique si pathogène reconnu sauf Neisseria (CNR)

Conclusion Adéquation avec les recommandations du Remic Oui pour les milieux de culture Variable pour les atmosphères d’incubation CBS : incubation sous CO2 et anaérobie CBN : incubation anaérobie fonction du type de flacon CBPE : incubation sous CO2 et anaérobie fonction du résultat de l’ED Conduite de l’examen bactériologique différente CBPE : place importante de l’ED CBS et CBN : procédure d’ensemencement systématique, complétée selon l’ED Identification et antibiogramme : attitude similaire

Tests classiques d’identification Flacons sans charbon seulement Staphylocoques : coagulase, DNase Listeria : esculine rapide Sur colonie indole oxydase catalase inutile

Comparaison des tests complémentaires Genre bactérien suspecté CBS CBN CBPE Staphylocoque Catalase Agglutination PCR nuc + mec A DNase Agglutination Coagulase Streptocoque supposé pneumocoque Agglutination si doute sur opto Listeria Mobilité à 20° et 37° Mobilité à 4°, 30° et 37° inutile 47