Beta-lactamases à spectre élargi Définition Résistance aux céphalosporines de troisième génération et à l’aztréonam Evolution moléculaire (TEM-1, TEM-2, SHV-1) Autres enzymes Classe structurale A de Ambler Groupe fonctionnel 2be de Bush, Jacoby, Medeiros

Classification de Ambler Site actif G KTG A SXXK 70-73 SXN 166 166 omega loop 164-179 234-236 C 64-67 YXN 208-213 315-317 D YGN 144-146 WxExxL 164-169 216-218 B Zn ++ 61-65 Zn1 ligand His 116, 118, 196 Zn2 ligand Asp120, Cys221, His263

ß-lactamase à spectre étendu (BLSE) Antibiotiques stables Inhibiteurs de ß-lactamase CTX TCC AMC IMP ATM CAZ FEP CTX TCC AMC IMP ATM CAZ FEP MOX MOX Images de synergies C3G/ Ac clav Antibiotiques stables Céfamycines (MOX) Imipénème

Evolution des ß-lactamases Intérêt médical carbapénèmes carbapénèmases céphalosopirinases plasmidiques Inhibiteurs enzymatiques ß-lactamases TRI-IRT ß-lactamases à spectre élargi Céphalosporines de 3eme génération (C3G) cephalosporinases hyperproduites ß-lactamases à spectre large ampicilline cephalosporinases inductibles 1944 1955 1965 1980 1990

BLSE dérivée de TEM-1/2 et SHV-1 ßLSE TEM 104 164 238 240 gly ser glu lys arg ser, his glu lys ßLSE SHV 179 238 240 asp arg, asn, gly gly ser, ala glu lys

Cefalotine Ceftazidime Céfotaxime

Passage de 1 à 2 mutations in vivo BLSE dérivée de TEM-1/2 Plus de 100 dérivés de TEM-1/2 Sélection in vivo TEM-12 : Ser 164 TEM-29 : His 164 Passage de 1 à 2 mutations in vivo TEM-12 TEM-23/26 Ser 164 + Lys 104 TEM-11 TEM-61 His 164 + Lys 240 TEM-7 TEM-129 1 mutation : 16 2 mutations : 33 3 mutations : 4 4 mutations : 1

Exemple de transposition – évolution (mutation) b-lactamase SHV-1 de Klebsiella pneumoniae Evolution du gène SHV Conséquences sur la résistance Chromosomique – 1 seul gène R bas niveau  Amoxicilline – ticarcilline [pipéracilline] K Gène LEN-1 TRANSPOSITION Plasmidique – multi copies R haut niveau  Amoxicilline – ticarcilline –pipéracilline C1G – C2G Gène SHV-1 K MUTATION Plasmidique - R haut niveau SPECTRE ETENDU ou ELARGI  Amoxicilline – ticarcilline –pipéracilline  C1G – C2G  C3G, ATM, Céfépime, Cefpirome K K SHV-2 = BLSE AUTRES MUTATIONS Nouvelles enzymes BLSE  SHV-3  SHV-4 ……

Généalogie SHV gène chromosomique gènes plasmidiques spectre large spectre élargi 1 mutation 2 mutations LEN-1 SHV-11 SHV-2a SHV-12 SHV-6 SHV-0 SHV-1 SHV-2 SHV-5 SHV-8 OHIO-1 SHV-7 SHV-44 SHV-3 SHV-4

Nouvelles ß-lactamases de classe A et résistance aux C3G CTX-M : Céfotaximase VEB-1 : Vietnamiense extended-spectrum ß-lactamase BES-1 : Brazilian extended-spectrum ß-lactamase GES-1 : Guyana extended-spectrum ß-lactamase SFO-1 : Serratia fonticola TLA-1 : TEM Like Activity IBC-1 : ????? PER-1, PER-2 : Pseudomonas aeruginosa

Phénotype des BLSE CTX<CAZ CAZ<CTX 512 4 64 BES-1 16 128 SFO-1 8 CTX-M-16* 32 256 CTX-M-15* 0,5 CTX-M-1 ATM FEP CAZ CTX 8 2 256 16 IBC-1 32 PER-1 1 VEB-1 4 0,5 64 CTX-M-19* 128 SHV-5 0,25 GES-1 SHV-2 TEM-24 TEM-3 ATM FEP CAZ CTX

Détection de la synergie C3G et acide clavulanique BLSE CTX-M Détection de la synergie C3G et acide clavulanique

* * * * * Arbre phylogénétique des CTX-M 2 31 Toho 1 20 7 6 4 5 17 27 9 16 19 18 14 24 13 21 26 25 8 10 12 30 29 3 28 15 Arbre phylogénétique des CTX-M 0.02 OXY - 1 CTX - M - 11 CTX - M - 22 CTX - M - 23 1 * Groupe M-1 (Kluyvera ascorbata) * Groupe M-8 (Kluyvera georgiana) Groupe M-25 Groupe M-9 (Kluyvera georgiana) * * * Groupe M-2 (Kluyvera ascorbata)

Enzymes CTX-M et résistance à la ceftazidime CTX-M-3 MVKKSLRQFTLMATATVTLLLGSVPLYAQTADVQQKLAELERQSGGRLGVALINTADNSQILYRADERFAMCSTSKVMAAAAVLKKSESEPNLLNQRVEI CTX-M-15 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- CTX-M-9 --T-RVQRMMFA-A-CIP-----A------SA------A--KS----------D----T-V---G----P---------------Q--TQKQ----P--- CTX-M-16 --T-RVQRMMFA-A-CIP-----A------SA------A—-KS----------D----T-V---G----P---------------Q--TQKQ----P--- CTX-M-19 --T-RVQRMMFA-A-CIP-----A------SA------A--KS----------D----T-V---G----P---------------Q--TQKQ----P--- ** * * * ***** ****** ****** ** ********** **** * *** **** *************** ** **** *** 167 CTX-M-3 KKSDLVNYNPIAEKHVNGTMSLAELSAAALQYSDNVAMNKLIAHVGGPASVTAFARQLGDETFRLDRTEPTLNTAIPGDPRDTTSPRAMAQTLRNLTLGK CTX-M-15 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- CTX-M-9 -PA-----------------T--------------T-------QL---GG------AI--------------------------T---------Q----H CTX-M-16 -PA-----------------T--------------T-------QL---GG------AI--------------------------T---------Q----H CTX-M-19 -PA-----------------T--------------T-------QL---GG------AI-----------S--------------T---------Q----H * ***************** ************** ******* *** ****** *********** ************** ********* **** 240 CTX-M-3 ALGDSQRAQLVTWMKGNTTGAASIQAGLPASWVVGDKTGSGDYGTTNDIAVIWPKDRAPLILVTYFTQPQPKAESRRDVLASAAKIVTDGL CTX-M-15 -----------------------------------------G------------------------------------------------- CTX-M-9 ---ET--------L----------R----T--TA--------------------QG----V---------QN------------R-IAE-- CTX-M-16 ---ET--------L----------R----T--TA-------G------------QG----V---------QN------------R-IAE-- CTX-M-19 ---ET--------L----------R----T--T---------------------QG----V---------QN------------R-IAE-- *** ******** ********** **** ** ******* ************ **** ********* ************ * **

Phénotype des BLSE CTX<CAZ CAZ<CTX 512 4 64 BES-1 16 128 SFO-1 8 CTX-M-16* 32 256 CTX-M-15* 0,5 CTX-M-1 ATM FEP CAZ CTX 8 2 256 16 IBC-1 32 PER-1 1 VEB-1 4 0,5 64 CTX-M-19* 128 SHV-5 0,25 GES-1 SHV-2 TEM-24 TEM-3 ATM FEP CAZ CTX

Une b-lactamase peut en cacher une autre Tic Tz Amx Pip Ctx Amc Caz Fox Imp Atm Tcc Cf Cpo Mox Fep Ma Une b-lactamase peut en cacher une autre Tic Tz Amx Pip Ctx Amc Caz Fox Imp Atm Tcc Cf Mox Fep Ma + cloxacilline Escherichia coli Produteur de Case plasmidique (CMY-2) et de BLSE

CMI imipénème 16-32 mg/l Genta-I (8 mg/l) Tétra-I (16 mg//l) Pip Tic Amx Tz Klebsiella pneumoniae VIM-1 et SHV-5 Fox Ctx Amc Caz Amk Net Tb Cip Ofx G Pi Te Sxt Cs Fos Cf Atm Fep Tcc Imp Ma Mox CMI imipénème 16-32 mg/l Genta-I (8 mg/l) Tétra-I (16 mg//l) S colistine

R-Imp inhibée par l’EDTA  métallo-b-lactamase avec EDTA IMP IMP+ EDTA R-Imp inhibée par l’EDTA  métallo-b-lactamase  Présence d’une BLSE

IS26 et expression des gènes bla SHV-2a IRL tcaccaccgactatttgcaacagtgccAACGCCGGGTTATTCTTATTTGTC-(N35)-GGATGTATTGTGGTTATG -35 -1O +1 RBS Start

ISEcp1 et nouvelles ß-lactamases -35 -10 GTA ATG nnnTTGAAAnnnnnnnnnnnnnnnnnTACAATnnnnnnnnnnnnnnn ISEcp1 tnpA Terminal Repeat CTX-M-17 CMY-4

Intégrons complexes de type In6-In7 CTX-M-2 ORF-3 MOX-1 ou CMY-1 ou CMY-9 DHA-1 (ampC) ampR CTX-M-9 ORF-3 like ORF 1005 5’ CS gènes cassettes 3’ CS tronquée ORF513 3’ CS dupliquée int I1 qac E∆1 sul 1 ORF513 qac E∆1 sul 1 ORF5

Evolution BLSE AP-HP

Emergence des CTX-M 1989 1995 2003 2005

Emergence de CTX-M-15 2001 2003 2005

Épidémie Canadienne (BOYD) pC15-1a : le fautif 92 kb Squelette R100 MDR (28 kb) Squelette R100

Souches = 84 E. coli (*responsables d'épidémie) Lieu d'isolement de E. coli Nom BLSE (groupe) nb Tenon Tn03 à Tn55 CTX-M1 35 CTX-M9 14 CTX-M2 2 Emile Roux ER1 à ER15 7* Lagny LA1 1 LA2 à LA10 9* Paul Brousse PB 1 (26)* Saint Joseph SJ01 Robert Ballanger RB Louis Mourier LM Necker NK Rothschild ROT Saint Michel SM Tunisie TU 1 (10)* Rép. Centrafricaine CAF 10 Beaujon Tem24 TEM

Épidémiologie Profils de migration des produits de rep-PCR du clone épidémique et de 4 autres souches n'appartenant pas à ce clone.

Électrophorèse en champ pulsé Épidémiologie Électrophorèse en champ pulsé ADN digéré par NotI En rouge: souches épidémiques En vert: souches témoins

Clone épidémique: Tenon 23 /51 3 20 Emile Roux 7 /7* Lagny 9 /9* Lieu d'isolement Nb épi./total BLSE Date isolement Tenon 23 /51 3 20 CTX-M-14 CTX-M-15 Jan.2001 -> déc.2004 Emile Roux 7 /7* Nov. 2004 Lagny 9 /9* Sept. -> nov. 2003 Paul Brousse 1 /1*(26) Oct.2001 -> mars 2003 Saint Joseph 1 /1 Mai 2003 Tunisie 1 /1*(10) Jan. 2000 -> juin 2003 R. C. A 2 /10 Fev. 2004 Beaujon TEM-24 2002 45 /84 * responsables d'épidémies

B2 II. Caractéristiques des souches appartenant au clone épidémique 1. Groupe phylogénétique Souches commensales B2 Souches Pathogènes (ExPEC)

Caractéristiques des souches appartenant au clone épidémique 2. Facteurs de virulence Rôle Adhésion Captation du fer Toxine Gène fimH papG sfa/foc iutA fyuA hlyA cnf1 résultat + -

1 clone Plusieurs phénotypes de résistance 2001 2005 France Tunisie République Centrafricaine 1 clone Plusieurs phénotypes de résistance ß-lactamines (CTX-M-15, CTX-M-14, TEM-24) aminosides tétracycline sulfamides…

Support génétique des gènes de résistance aux C3G 1. Transfert de la résistance par conjugaison ou transformation Support plasmidique 2. Détermination du groupe d'incompatibilité des plasmides Appartenance au groupe incFII ? plamide Tn03 Tn08 Tn36 Tn49 LA2 ER15 SJ 01 PB TU CAF Tn25 Tn 32 Tem 24 incFII oui non BLSE produite CTX-M-15 CTX-M-14 TEM-24

Profils de restriction des plasmides possédant blaCTX-M-15 Digérés par HpaI 23kb 9,4 kb 6,6kb 4,4kb 2,3kb 2,0kb

Étude des plasmides par Southern-blot Gènes de résistance Sonde CTX-M Co-localisation des gènes de résistance (région MDR ? Boyd…) Squelette plasmidique commun ?

Étude des plasmides par Southern-blot

Étude des plasmides possédant blaCTX-M-15 par PCR Région MDR correspondant à celle décrite par Boyd ? Recherche séquences partagées avec pC15-1a : Gènes de résistance aux antibiotiques tetA, blaOXA-1, blaTEM-1, aac(6')-1b, aac(3)-II Éléments mobiles (jonctions) nommées MDRx

Étude des plasmides possédant blaCTX-M-15 par PCR

47% séquences id. pC15-1a 88% séquences id. pRSB107 Étude du squelette de ce plasmide résultats de l'analyse des séquences de 11 des clones obtenus : 5989 bases 2114 b (35%) partagées avec pC15-1a et pRSB107 733 b (12%) partagées avec pC15-1a seulement 3142 b (53%) partagées avec pRSB107 seulement 47% séquences id. pC15-1a 88% séquences id. pRSB107

virulence transfert pC15-1a et/ou R100 métabolisme résistance

Diffusion de ce plasmide chez d'autres bactéries ? E. coli n'appartenant pas au clone épidémique ? Autres entérobactéries blaCTX-M-15 + (K. pneumoniae (8), S. marcescens (1), S. enterica (1)) Souches candidates : multirésistantes PCR incFII+ pemK+ Extraction puis digestion de leurs plasmides confirmation par southern-blot

Diffusion de ce plasmide chez d'autres bactéries ? OUI n'ont pas disséminé ! Mais Hybridation avec sonde squelette rep-PCR : Profils isolés

E. coli B2 (UPEC) Cipro R Association E. coli B2 (UPEC) de Cipro R Squelette incFII Région MDR Véhicule différents plasmide de résistance Infections nosocomiales Association de malfaiteurs E. coli B2 (UPEC) Cipro R multirésistant Infections communautaires épidémies France Tunisie R.C.A … ? 2001 2005 … ?

des Streptomyces aux champignons Arbre évolutif Antibiotiques Homo sapiens mammifères bactéries archae champignons 3400 370 3500 1700 65 0,25 Gram - Gram + Synthèse des ß-lactamines Transfert de la synthèse des ß-lactamines des Streptomyces aux champignons (Penicillium, Cephalosporium)

Phylogénie des PBP et des beta-lactamases Beta-lactamases Classe D Beta-lactamases Classe B Beta-lactamases Classe C Beta-lactamases Classe A PBP High PM Classe C PBP High PM Classe A PBP High PM Classe B PBP low PM Classe A PBP low PM Classe C PBP low PM Classe B PBP primordiale

Beta-lactamases et PBP + PBP ß-lactamine + ß-lactamase