Place de la biologie moléculaire dans le diagnostic de la tuberculose Pr. Farouk Barguellil Service de Biologie Clinique Hôpital Militaire de Bizerte

Applications des méthodes de biologie moléculaire à la mise en évidence des mycobactéries Les méthodes de biologie moléculaire offrent une plus grande sensibilité de sorte qu’ils permettent de détecter de très petits nombres d’organismes en augmentant la quantité de leur acide nucléique.

La détection de M. tuberculosis est une application idéale de ces techniques parce que leur culture est lente et exige des installations spécialisées en raison du risque biologique.

Les méthodes d’amplification pourraient s’avérer rapides, relativement peu coûteuses et sûres et, parce qu’elles sont déjà couramment utilisées pour identifier d’autres organismes, elles ne nécessitent pas des installations très spécialisées.

Bien que ces tests soient hautement spécifiques, ils n’ont pas encore fait la preuve de leur sensibilité et ne peuvent donc pas remplacer les cultures.

En outre, la culture restera indispensable, au moins dans un avenir prochain, pour la réalisation de l’antibiogramme, le typage et la production de bacilles en vue d’une étude plus poussée.

Méthodes de biologie moléculaire et mise en évidence des mycobactéries La recherche directe de Mycobacterium tuberculosis, dans les prélèvements en utilisant l'hybridation moléculaire in situ avec les sondes nucléiques spécifiques est peu sensible, et ses performances ne sont pas meilleures que celles de l'examen microscopique après coloration de Ziehl.

La mise en évidence de mycobactéries par Polymerase Chain Réaction (PCR) Elle permet de déceler en 24 heures la présence d'une mycobactérie appartenant au complexe tuberculosis dans un prélèvement, en amplifiant des séquences génomiques spécifiques.

Un grand nombre de méthodes d’amplification ont été évalués et analysés dans la littérature. Dans tous les cas, ils sont comparés à la culture, qui est la méthode de référence, et dans de nombreuses études, ils sont évalués à la lumière des signes cliniques et du diagnostic.

Cibles de l’amplification de M. tuberculosis complex Gènes présents en copie unique gène codant pour l’antigène de 65-kD (HSP) Brisson-Noel et al. Lancet 1989 gène codant per l’antigène de 126-kD (protéine de fusion) Hermans et al. J.C.M. 1990 gène codant per l’ ARNr 16S Boddinghaus et al. J.C.M. 1990 gène codant pour l’antigène de 38-kD (protéine b) Miyazaki et al. J.C.M. 1993 Séquence répétée IS6110 Eisenach et al. J.I.D. 1990

Il existe maintenant des tests d’amplification pour la détection de. M Il existe maintenant des tests d’amplification pour la détection de M. tuberculosis dans des échantillons cliniques. Ces tests se divisent en 2 groupes : - PCR « maison » - Kits prêts à l’emploi TESTS D’AMPLIFICATION

PCR « maison » dans un premier temps, on amplifie des segments spécifiques de l’ADN de M.tuberculosis,

Un appareil de PCR et la révélation UV d'un produit amplifié après électrophorèse sur gel

Kits prêts à l’emploi La plupart des tests commerciaux permettent d’obtenir des résultats en 4 à 6 heures. Lorsqu’elles sont utilisées sur des échantillons cliniques d’expectorations, ces épreuves offrent une : - sensibilité d’environ 95 % dans le cas des échantillons pour lesquels le frottis était positif, - et de 50 % à 60 % lorsque le frottis était négatif. Quant à la spécificité, elle est excellente, soit de 98 %.

A l’heure actuelle, ces épreuves ne sont recommandées que pour les échantillons respiratoires dont le frottis était positif. Leur utilité pourrait s’accroître dans un avenir prochain si l’on parvient à améliorer leur sensibilité et à abaisser leur coût.

La méthode a été codifiée et l'apparition sur le marché de kits prêts à l'emploi a récemment contribué à sa vulgarisation en standardisant les réactifs et en uniformisant les méthodologies

Recommandations générales Nature des prélèvements biologiques testés Les tests d'amplification ne sont validés par le fabricant que s'ils sont réalisés à partir de prélèvements d'origine respiratoire (crachats, aspirations bronchiques, LBA, tubages gastriques...).

Technique de décontamination fluidification Seules les techniques de décontamination fluidification utilisant l'hydroxyde de sodium (NaOH) ou l'hydroxyde de sodium / N-acétyl L-cystéine (NaOH / NALC) sont validées. Le lauryl sulfate de sodium et le chlorure de benzalkonium, pouvant être inhibiteurs de l'amplification, ne doivent pas être utilisés.

On soumet les mycobactéries présentes dans le culot de centrifugation à la lyse par différents agents physico-chimiques. La cible est libérée, elle peut alors être amplifiée. Plusieurs techniques ont été décrites : A - Tests Amplicor pour la détection de M. tuberculosis complex et pour la détection de M. avium complex (Roche). B - Test AMTDT M. tuberculosis complex (Gen Probe / bioMérieux). C - Test LCx M. tuberculosis complex (Abbott).

Le test d'amplification Amplicor® (Roche) permet, soit la mise en évidence des mycobactéries du complexe tuberculosis, soit celle de Mycobacterium avium-intracellulare. Magna Pure (extraction) Cobas Amplicor Amplicor MTB

Test d'amplification AMPLICOR Deux méthodes sont utilisées pour la détection de M. tuberculosis complex : - Amplicor M. tuberculosis complex : détection manuelle (en microplaques). - Cobas Amplicor M. tuberculosis complex : détection automatisée (au Cobas).

Principe Les tests AMPLICOR sont des tests qualitatifs de diagnostic in vitro qui permettent de déceler la présence de M. tuberculosis dans des échantillons cliniques. Le principe de ce test repose sur l'amplification par la Taq polymérase de la partie spécifique du gène de l'ARN 16 S.

Les amorces biotinylées permettent le marquage de l'amplicon Les amorces biotinylées permettent le marquage de l'amplicon. Après hybridation à une sonde spécifique, le complexe Amplicon biotinylé-sonde est révélé par une réaction enzymatique. La présence d'un contrôle interne d'amplification permet de déceler la présence d'inhibiteurs.

Test d'amplification AMTDT (Gen-Probe/ BioMérieux) Principe Le principe de ce test repose sur l'amplification d'une cible d'ARN ribosomal par la reverse transcriptase. Le DNA complémentaire est ensuite transcrit en RNA par la RNA polymérase. Cet amplicon est hybridé à une sonde ADN conjuguée à un marqueur chimioluminescent. Le signal lumineux émis par les hybrides ARN-ADN est mesuré à l'aide d'un luminomètre.

AMPLIFIED : détection directe à partir de l'échantillon clinique Mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis (à partir d'échantillons respiratoires) Les tests AMPLIFIED utilisent la méthode d'amplification TMA (Transcription-Mediated Amplification). Cette technologie permet d'amplifier l'ARN ribosomal en 1 heure. Elle est isotherme et ne nécessite pas d'étape de transfert ni de lavage.

Luminomètre LEADER 50i Le LEADER 50i est le luminomètre qui permet la lecture des tests ACCUPROBE, PACE 2 et AMPLIFIED. Il est simple à utiliser : après injection automatique des réactifs de détection, il mesure le signal émis par l'ester d'acridinium (chimiluminescence), interprète et imprime les résultats

Test d'amplification génique par méthode LCx   Principe Dans son principe, ce test fait intervenir quatre sondes nucléotidiques qui reconnaissent une partie d'une séquence cible de l'ADN chromosomique des mycobactéries du complexe tuberculosis, sur laquelle elles se fixent de façon adjacente.

Le test d'amplification génique par la méthode LCx® (Abbott). Dans un premier temps, une DNA polymérase thermostable comble les espaces entre les amorces, ensuite une ligase thermostable réunit les fragments les uns aux autres (ligase chain reaction).

La LCR (ligase chain reaction)

La SDA (Strand displacement Amplification ou Amplification par déplacement de brin) La SDA permet la détection qualitative et la quantification d'acides nucléiques. Un automate a été développé pour cette technique. Il s'agit du BDProbeTec™ ET system (Société Becton Dickinson). Plusieurs kits ont été développés par cette société. Ils présentent tous un contrôle interne d'amplification et utilisent le système dUTP/UNG

Un kit pour la détection des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis pour les échantillons d'origine respiratoire et un pour l'identification en culture du complexe Mycobacterium tuberculosis, du complexe M. avium et de M. kansaii (Mycobacterial assay BDProbeTec™)

La CPR (cycling probe reaction) Il s’agit d’une amplification par dégradation de sonde (plus précisément une amplification de fragments de sonde ). Elle permet la détection du complexe Mycobacterium tuberculosis. Il existe un kit commercialisé aux USA ( Velogene™ Genomic Identification assay).

Technique de détection rapide de la résistance des mycobactéries du complexe tuberculosis à la rifampicine Nature des prélèvements testés Ce test peut être pratiqué directement à partir d'une culture de Mycobacterium tuberculosis ou du complexe tuberculosis obtenue soit en milieu solide, soit en milieu liquide. Il ne mentionne aucune recommandation concernant l'âge de la culture. L'efficacité de ce test n'a pas été démontrée pour une application directe à partir des prélèvements

Méthodologie Une seule technique est actuellement commercialisée par les laboratoires Innogenetics, c'est la technique Inno-Lipa Rif TB. Les résultats donnés par le test Inno-Lipa Rif TB doivent être confirmés par un test phénotypique de sensibilité à la rifampicine

Principe Le principe du test repose sur l'amplification par PCR de la région du gène rpo B dans laquelle surviennent les mutations qui entraînent la résistance de la souche à la rifampicine. En même temps que se réalise l'amplification, l'amplicon subit une biotinylation. L'hybridation du produit d'amplification avec des sondes immobilisées sur un support de nitrocellulose est révélée par réaction de la biotine avec la streptavidine couplée à la phosphatase alcaline.

Exemple de l'identification d'une espèce de mycobactérie avec le réactif Inno-Lipa®

ANALYSE CRITIQUE Bien que ces tests soient hautement spécifiques, ils n’ont pas encore fait la preuve de leur sensibilité et ne peuvent donc pas remplacer les cultures.

En outre, la culture restera indispensable, au moins dans un avenir prochain, pour la réalisation de l’antibiogramme, le typage et la production de bacilles en vue d’une étude plus poussée.

Des chercheurs se sont penchés sur des méthodes d’amplification destinées à mesurer l’ARNm pour évaluer la viabilité des organismes dans un échantillon clinique .

Des méthodes de PCR rapides et des méthodes d’amplification par PCR spécifiques pour les différents genres sont maintenant en cours de développement.

Il est probable que ces tests d’amplification auront des répercussions importantes sur les méthodes de travail dans les laboratoires de tuberculose au cours des quelques prochaines années.

Amplification génique alternative à l’examen microscopique? Avantages : sensibilité supérieure spécificité d’espèce (et éventuellement de genre) Inconvénients exécution complexe Coût élevé

Amplification génique alternative à la culture? Avantages Plus rapide Si positive elle rend superflue l’identification Se pratique sur échantillons contaminés Inconvénients Moins sensible Ne détecte pas les autres mycobactéries Faux négatifs dus aux inhibiteurs de la Taq pol Faux positifs dus à une contamination Coût élevé exécution complexe impossibilité de faire l’antibiogramme

Diagnostic direct par amplification génique TB - VPN et sensibilité : présence de FN (prélèvement extrapulmonaire) - Inhibiteurs polymérase dans les prélèvements - Marqueurs d’inhibition : séquence ADN différente + ses primers - Sensibilité + par rapport à l’ED : USA - ± par rapport à la culture : France

Diagnostic par PCR de la TB PCR cible : 16S rRNA, IS6110 Avantages Limites Sensible Résistance aux ATB Spécifique Infection/Maladie ? Rapide Faux pos/neg Simple Coût

Stratégies d’emploi amplification génique Prélèvements extra pulmonaires / pulmonaires ED- Amplification génique MTB Pronostic vital enjeu Diagnostic différentiel

PERSPECTIVES

Puces ADN - ‘Genome sur une lame’ M. tuberculosis H37Rv 22 x 22 mm 4896 spots Génome 3924 gènes Une sonde pour 1 gène

INH untreated - green INH treated - red Overlay Yellow = Red + Green (no change in expression) Green = only expressed without INH treatment Red = only expressed after INH treatment

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