M. Alessandra Rosenthal-Allieri Laboratoire Central d’Immunologie Hôpital de l’Archet CHU-Nice Lymphocytes B

Fonctions : a) l’activation par l’Ag induit leur transformation en plasmocytes (immunoglobulines sécrétées) b) capacité de se comporter en CPAg : peuvent fixer un Ag soluble : - spécifiquement par BCR - non spécifiquement par les récepteurs des complexes immunes pour les parties constantes des IgG ou pour les fragments du C3 puis l’endocyter, le dégrader, le ré-exprimer à la surface, associé aux molécules HLA classe II, et le présenter aux lymphocytes T CD4+ Sous-populations : pas de sous-populations comme pour les lymphocytes T, hormis les B-1 des cavités séreuses Origine :- Bourse de Fabricius (oiseaux) - moelle osseuse (homme) Lymphocytes B

Immunoglobulines : caractéristiques 5 isotypes, définis par la nature de la chaîne lourde : IgG (IgG1 à 4) IgM IgA (IgA1 et 2) IgD IgE Bifonctionelles :Extrémité N terminal : régions charpentes ( framework FR1 à 4) zones hyper-variables (complementary determining regions = CDR 1 à 3): spécificité Extrémité C terminale : Fc (fonctions effectrices : capacité à activer le C’, à se lier aux FcR) Répartition :IgM intra-vasculaires IgG sérum et tissus IgA surface muqueuse respiratoire et intestinale IgE liées aux mastocytes et basophiles

Représentatin tri-dimentionnelle d'une IgG2a de souris Les chaînes lourdes ont colorées en jaune et en turquoise, les chaînes légères en vert et en violet. Les glycosylations sont indiquées en rouge.

Immunoglobulines : génétique Trois complexes génétiques :IgH en 14q32 Ig  en 2p12 Ig en 22q11 Chaque complexe se compose de 3 ou 4 régions :V = variables D = diversité J = chaîne J C = constant Lorsque un précurseur lymphoïde s’oriente vers la lignée B, le génome codant pour les chaînes des Ig va subir des réarrangements au hasard : Chaînes lourdes : un gène D va se rapprocher au gène J (DJ), puis le gène V H se rapproche (VDJ) Chaînes légères : seul existe le rapprochement VJ Chaque gène V contribue environ aux premiers 100 Aa du domaine variable, tandis que les segments D et J codent pour les derniers Aa. L’ensemble VDJ constitue le 3ème CDR, composant essentielle de la spécificité Ab

Les réarrangements et l'expression des gènes d'Ig se déroulent selon une cinétique ordonnée et sont contrôlés à trois niveaux distincts : 1)la lignée cellulaire. Les Ig ne sont exprimées que par les lymphocytes B. 2) le stade de la différenciation cellulaire. Au sein d'une lignée cellulaire, les recombinaisons et l'expression des gènes d'Ig sont ordonnées selon le stade du développement de la cellule. Ainsi, les réarrangements et l'expression des gènes du locus IgH précèdent ceux des gènes des chaînes légères. De plus, au sein du locus IgH, les réarrangements des segments géniques sont temporellement régulés. 3) exclusion allélique. Le réarrangement complet sur un des allèles, aboutissant à la formation d'un produit VHDJH ou VLJL codant, entraîne l'inhibition du réarrangement sur l'autre allèle.

La réaction de recombinaison V(D)J se produit en deux phases distinctes.

Les régions variables des anticorps sont codées par l'association d'un segment V, d'un segment D pour les chaînes lourdes, et d'un segment J, par un mécanisme appelé 'recombinaison V(D)J'. Le grand nombre de segments V, D et J disponibles, les multiples combinaisons entre ces éléments (diversité combinatoire) ainsi que l'imprécision de leurs jonctions (diversité jonctionnnelle) contribuent considérablement à la diversité des anticorps. Les recombinaisons entre les différents segments V des gènes de chaîne lourde et légère s'effectuent à des sites spécifiques nommés RSS (séquence signal de recombinaison), disposées de façon à ce que les recombinaisons ne puissent se faire qu'entre segments D et J puis V et D pour les chaînes lourdes, et qu'entre V et J pour les chaînes légères. Les recombinaisons V(D)J mettent en jeu une machinerie enzymatique composée des protéines RAG-1 et RAG-2 (pour 'Recombinaison Activating Gene') exprimées exclusivement dans les lymphocytes B et T au stade du développement où les gènes des récepteurs antigéniques sont réarrangés. Recombinaison en deux phases: 1.les protéines RAG-1 et -2 reconnaissent et assemblent en un 'complexe synaptique' les RSS asymétriques de deux segments de gènes, puis induisent une cassure double brin de l'ADN. Chaque clivage conduit à la production d'une extrémité franche au niveau des RSS et d'une structure intermédiaire en 'épingle à cheveu' au niveau de la séquence codante. 2.les cassures sont identifiées, traitées et réarrangées par la machinerie ubiquitaire de réparation de l'ADN.De manière générale, les extrémités codantes sont rapidement assemblées en jonctions codantes avec ouverture de la structure en épingle et des modifications favorisant la diversité des récepteurs antigéniques par l'addition et/ou la délétion de nucléotides. par la déoxynucléotidyl terminale transférase (TdT). La TdT est exprimée précocement dans la différenciation B, au stade pro-B, lors des réarrangements des gènes du locus IgH. Si un cadre de lecture ouvert est obtenu, l'exon variable V(D)J ainsi formé sera transcrit. L'ARN sera ensuite épissé puis traduit pour permettre la synthèse d'une chaîne lourde ou légère. Réarrangements des gènes d'immunoglobulines

Le BCR Lymphocytes B : les seules cellules à porter sur leur surface des IgS (environ /cellule) IgS : récepteur spécifique pour l’Ag, synthétisé et exprimé avant toute rencontre avec l’Ag Chaque lymphocyte B n’est porteur que d’un seul isotype  ou (2/3 , 1/3 ) et la forme dimérique de la chaîne µ, souvent associées aux chaînes  : phénotype IgM+ IgD+ = cellule matures. Isotypes ,  et  sont < 1% dans le sang, mais IgA surtout dans le tissu lymphoïde associé aux muqueuses IgS : même structure que l’Ig sécrétée avec modification de l’extrémité C’ des chaînes lourdes pour leur encrage sur la membrane Le BCR est étroitement associé à un complexe multi-moléculaire pour la transduction du signal d’activation : dimères Ig  (CD79  ) Ig  (CD79  ), analogues fonctionnels du CD3 dans le T

Molécules de surface du lymphocyte B 1) Marqueurs de la lignée B (panB) -CD19: phosphoprotéine, forme des complexes avec CD21 et CD81 (TAPA). Stabilise le BCR à tous les stades (plasmocytes) -CD20: molécule de canal calcique, apparaît sur les cellules matures -CD22 impliquée dans le signal de transduction du BCR -CD23: ou Fc , clivable et présent ans le sérum sous forme soluble -CD10 : endopeptidase neutre (CALLA : common acute lymphoid leukemia antigen) présent à la fois aux stades précoces de la lymphopoïèse et sur les B matures activés intra-folliculaires -CD21 récepteur pour C3d du complément : lorsque un Ag active le système complémentaire avec production de C3d, il se produit un co-engagement des IgS et de CD21, induisant leur rapprochement sur la membrane. CD21 est étroitement liée à CD19, dont la queue intra-cytoplasmique liée à la tyrosine kinase lyn provoque des activation moléculaires en cascade (signalling)

2) Récepteur pour l’Antigène

3) CD32 (RFc  IIB) : Fonctions différentes du RFc  II A et B ( 2 gènes producteurs) RFc  IIA sur phagocytes -déclenche l’endocytose des particules revêtues d’Ag -possède dans sa queue cytoplasmique une séquence ITAM-like phosphorylable et capable d’initier une cascade activatrice Syk dépendante, activant la phagocytose et la secretion de cytokines inflammatoires RFc  IIB sur phagocyte, mastocytes, lympho B -pas de phagocytose, mais rétrocontrôle de la synthèse d’Ac. -séquence ITIM intra-cytoplasmique activant une tyrosine phosphatase (SHIP) dont l’activation va inhiber diverses fonctions cellulaires Lorsque un complexe Ag/Ac provoque un co-engagement des IgS et des RFc  IIB il y a potentialisation de l’activation lymphocytarie mais aussi retro-contrôle de la synthèse d’Ac par des Ac de même spécificité, pour éviter des recrutements cellulaires inutiles. De même, lorsque des complexes immuns à IgG sollicitent simultanément le RFc  IIA et le RFc  IIB sur les macrophages, le résultat net est l’inhibition de la phagocytose (PTI et IgG IV)

4) CD40 L’oligomérisation du TCR induit l’expression du CD40 ligand (CD40L ou CD154) sur le T qui en s’associant à son contre récepteur CD40, constitutivement exprimé sur les B, représente un puissant signal de : - prolifération et de prévention d’apoptose - de commutation isotypique L’activation de CD40 provoque l’apparition de CD86 et ensuite de CD80 sur le B, récepteurs de CD28 sur le lymphocyte T : amplification de la réponse cytokinique du T, production de cytokines favorisant la différentiation des B et la production d’Ac. Internalisation Ag Reconnaissance de l’Ag Ré-expression des peptides Ag à la surface en association à HLA classe II Présentation aux lymphocyte T : dialogue T-B BCR

La différentiation des lymphocytes B 2 grandes phases dans l’ontogénie B : 1) antigène indépendante 2) antigène dépendante Différenciation Maturation Production d’Ac Lympho B mémoire

Moelle osseuse Foie foetal IL7 Stem cell factor Cellules matures exprimant le BCR Quittent la moelle pour aller dans les organes lymphoïdes périphériques À partir des cellules CD34+ CD19+ CD24+ CD10+ CD20+ CD22+ 1) Maturation antigène indépendante

Les molécules qui caractérisent la lignée B apparaissent progressivement et permettent de définir chaque étape de maturation: Antigènes exprimés B1 CD19, CD22, CD79b B2 CD19, CD22, CD79b CD10 B3 CD19, CD22, CD79b CD10C Mu cytopl. B4 CD19, CD22, CD79b +/-CD10IgM de surface

2) Maturation antigène dépendante Dans les follicules lymphoïdes les B deviennent des cellules matures primaires capables de répondre à l‘Ag. En l’absence d’Ag : mort par apoptose après quelques semaines. Contrairement au répertoire du T mature à la sortie du thymus, celui des lymphocytes B primaires est poly-réactif et auto-réactif : la sélection se fait au sein des centres germinatifs des follicules lymphoïdes avec mise en place d’un répertoire spécifique et sans auto-réactivité. Les follicules lymphoïdes primaires sont constitué d’un dense réseau de cellules dendritiques folliculaires qui présentent les Ag aux B. Les lymphocytes B activés par le BCR et aidés par les lymphocytes T via le couple CD40/CD40L, après une phase d’expansion clonale, deviendront des plasmocytes secrétant des IgM.

Organes lymphoïdes secondaires Follicules lymphoïdes primaires L’accès à cette « niche de survie » est soumis à compétition et les lymphocytes B immatures auto-réactifs ayant rencontré l’Ag ne peuvent y pénétrer et meurent par apoptose en 72h (phénomène lié à la perte de récepteurs des chimiokines impliqués dans cette migration) Mécanisme de contrôle qui « purge » le système immunitaire des lymphocytes B possédant une forte affinité pour les autoAg : clones potentiellement dangereux

1.Activation initial T et B 4.Sécrétion d’Ac par plasmocytes 3.Prolifération et différenciation B 2.Activation B Ganglion

Rate

2) Maturation antigène dépendante - suite Après initiation de la réponse dans la zone T, quelques rares cellules B gagnent les follicules primaires pour donner naissance aux centres germinatifs où ont lieu : - Expansion clonale d’un nombre initial très limités de B - Hypermutations somatiques ponctuelles des régions variables des chaînes H et L - Sélection positive des B spécifiques de l’Ag - Différenciation en plasmocytes ou lymphocytes B mémoire

Les lymphocytes B activés entrent dans le follicule lymphoïde et se multiplient, puis se regroupent dans la zone sombre du centre germinatif: ils sont appelés centroblastes (IgM-, CD5-, CD38+). Les petits lymphocytes recirculants sont refoules en périphérie et forment la zone du manteau (IgM+, IgD+, CD5+). En se divisant, les centroblastes: -accumulent de nombreuses mutations somatiques qui modifient l’affinité de l’Ig -modifient la spécificité isotypique (commutations de classe) des Ig synthetisées. Les lymphocytes se transforment en centrocytes, migrant dans le zone claire du centre germinatif : re-expression de IgS. Les CDF présentent des antigènes natifs à leur surface. La reconnaissance de l’Ag induit pour le centrocyte un signal de survie, tandis que les cellules B ayant une affinité insuffisante pour l’Ag subissent l’apoptose (coopération T-B via CD40/CD40L). Rôle des cytokines dans ces phénomènes (ex. IL-4 = IgE, TGF  = IgA) 2) Maturation antigène dépendante : follicules

Lymphocytes B mémoire Lymphocytes impliqués dans la réponse immunitaire secondaire, par opposition aux lymphocytes vierges de la réponse primaire Les cellules mémoire sont quiescents, en phase G0 et présentent des caractéristiques différentes des cellules naives : - durée de vie plus longue - nombre d’IgS plus faible, mais de meilleure affinité pour l’Ag L’Ag ne se fixera que sur les cellules possédant un récepteur de haute affinité Ceci sélectionne les clones capables de produire des IgS de haute affinité pour l’Ag Ces cellules présentent les Ag CMH classe II fortement exprimés

Lymphocytes B : sous populations Lymphocyte B :CD23+ CD21+ Cavité péritonéale production d’autoAc Lymphoprolifération malignes B pas éliminés dans la moelle osseuse, ni rendus anergiques en périphérie Lymphocytes B-1 :CD21+ CD5+ CD23- IL-12 dépendants

VH Variabilité de l’ISOTYPE des Ig sécrétées par une cellule B COMMUTATION ISOTYPIQUE ou SWITCH