OUTILS DE GENIE GENETIQUE Dr. BENSAFI-GHERAÏBIA Faculté de Médecine Université Badji Mokhtar-Annaba 2015-2016

Génie génétique Ensemble des techniques de manipulation du matériel génétique (ADN, ARN) à des fins pratiques pour utiliser, reproduire, ou modifier le génome des êtres vivants

Le code génétique est le même pour tous les êtres vivants Un même gène donnera toujours la même protéine, peu importe l'espèce de l'individu On peut introduire un gène d'une espèce dans une autre espèce = génie génétique

ADN recombinant (ou recombiné) Connaissances permettant de transférer du matériel génétique d’un organisme à un autre ADN recombinant (ou recombiné) ADN hybride obtenu in vitro par combinaison de deux molécules d’ADN appartenant à deux espèces différentes

Petites molécules d’ADN double brin, circulaires Les plasmides Petites molécules d’ADN double brin, circulaires A localisation extrachromosomique Présents chez la plupart des espèces bactériennes A réplication autonome (=réplicons) indépendamment des chromosomes Chromosome bactérien circulaire Plasmides Bactérie

ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt VECTEUR L'ADN recombinant provient d'une combinaison entre l'ADN d'un organisme donneur et celui d’un vecteur (qui peut être d'une espèce totalement différente) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) Ex: gène associé à une maladie L’ADN dans lequel on insère l’ADN à étudier et qui sert de support L’ADN inséré est appelé « insert », « ADN exogène » ou « ADN étranger » Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Obtention d'un ADN Recombinant Amplification de cet ADN, expression des protéines correspondantes...

On extrait les plasmides de bactéries Une enzyme ouvre les plasmides On extrait ou on synthétise le gène à greffer On mélange des copies du gène et des plasmides. Une enzyme fusionne les brins d'ADN Les plasmides sont réintroduits dans des bactéries Le gène est reproduit quand la bactérie se reproduit

Applications pratiques Thérapie génique Vise à remplacer ou complémenter un allèle mutant défectueux par un allèle fonctionnel A surexprimé une protéine dont l'activité aurait un impact thérapeutique (Production de protéines d’intérêt médical) Vaccins…

Applications pratiques Plantes transgéniques Plantes résistantes aux insectes Résistantes aux herbicides Fruits et légumes qui se conservent plus longtemps Nouvelles saveurs Plantes plus riches en certains éléments nutritifs (vitamines)…

Applications pratiques Animaux transgéniques Animaux à croissance plus rapide Plus faibles en gras Plus productifs (en lait, en viande, en œufs) Production de protéines à usage pharmaceutique (ex: insuline) DANGERS ????? Pour la santé ? Pour l'environnement ?

Les enzymes en génie génétique 1- Les nucléases les nucléases dégradent les molécules d'ADN en rompant les liaisons phosphodiesters liant un nucléotide au suivant Il existe 2 types de nucléases

Les exonucléases coupent aux extrémités les endonucléases coupent des liaisons internes

Dans le sens 5’ vers 3’ou l'inverse 1-1- Exonucléases Ces enzymes éliminent des nucléotides un à un à partir d’une extrémité de l’ADN Dans le sens 5’ vers 3’ou l'inverse Ex: Exonucléase III catalyse l’hydrolyse séquentielle des nucléotides d’un ADN à partir d’une extrémité 3’ libre (dans le sens 3’ vers 5’)

A clivages non spécifiques 1-2- Endonucléases A clivages non spécifiques Ces enzymes sont capables de rompre des liaisons phosphodiesters internes La DNase extraite du pancréas Coupe préférentiellement après une base pyrimidique La nucléase S1 Isolée d’un champignon, Aspergillus oryzae Dégrade seulement les acides nucléiques monocaténaires

Enzymes de restriction A clivages non spécifiques Enzymes de restriction Molécules extraites à partir de microorganismes (généralement des bactéries) et qui coupent les liaisons phosphodiesters au niveau des acides nucléiques

Enzymes de restriction Fabriquées par les bactéries Protègent les bactéries contre l’invasion par de l’ADN étranger qu’elles coupent en petits morceaux Reconnaissent des séquences spécifiques de 4 à 8 nucléotides Coupent l’ADN sur ces sites définis (sites de restriction) Créent des bouts qui sont complémentaires La taille des fragments d’ADN produits dépend de la distribution des sites de restriction

Sites de restrictions ? Sites spécifiques de nature palindromique La lecture des deux brins complémentaires dans des sens opposés donne la même séquence 5’ ATGCTAGCTAGCAT 3’ 3’ TACGATCGATCGTA 5’

Les enzymes de restriction peuvent couper en faisant des extrémités franches (même taille d'ADN sur chaque brin), ou des extrémités cohésives (5' sortantes, ou 3' sortantes)

Ces enzymes de restriction sont classés en fonction de leur site de reconnaissance et leur lieu de coupure

À quoi servent les enzymes de restriction ? À couper l ’ADN à des séquences spécifiques Créent des extrémités, pouvant s ’apparier et être reliés par la ligase Comment peut-on amplifier un gène ? Par clonage dans des bactéries qui se multiplient (Amplifient l’ADN (in vivo)) Par PCR (Enzymes amplifient l’ADN (in vitro)) Quelle est l’utilité de l’amplification ? Obtenir un très grand nombre de molécules identiques (gènes) pour pouvoir en étudier la fonction

Elle est capable d'effectuer des ligations entre 2 ADN a bouts francs 2- Ligase Il est possible d'assembler deux fragments d'ADN avec l'utilisation d'une ligase Catalyse la formation d'une liaison phosphodiester entre deux segments d'ADN 2-1- ADN ligase L'enzyme n'agit que si les 2 ADN sont associés par des extrémités cohésives 2-2- T4 ADN ligase Elle est capable d'effectuer des ligations entre 2 ADN a bouts francs Ex: Insérer une séquence d'ADN dans un plasmide pour générer un vecteur d'expression

3- Les enzymes modifiant l’ADN: De nombreuses enzymes modifient l'ADN par addition ou suppression de groupes chimiques spécifiques 3-1- Les phosphatases Catalysent l’élimination d’un groupement phosphate en 5’ Empêchant donc la formation de liaison phosphodiester (empêche toute action des ligases) Ex: Déphosphoryler un vecteur que l’on vient d’ouvrir par un enzyme de restriction, afin d’éviter une refermeture de ce vecteur (auto-ligation) qui empêcherait alors d’insérer le fragment d’ADN à étudier

3-2- les kinases Les kinases permettent le transfert d’un groupement phosphate à partir d’une molécule d’ATP Il s’agit du phosphate en position gamma (le plus externe des trois groupements fixés sur l’Adénosine). Il sera transféré à l’extrémité 5’ d’un ADN déphosphorylé

4- Les polymérases et enzymes apparentées Les polymérases d'acides nucléiques sont des enzymes qui synthétisent un nouveau brin d'ADN complémentaire a une matrice d'ADN ou ARN, s’effectue de manière complémentaire et antiparallèle L’addition des nouveaux nucléotides se faisant dans le sens 5’ P vers 3’ OH

4-1- L’ADN polymérase I Extraite d'Escherichia coli, elle joue un rôle majeur dans la réparation de l'ADN Est constituée d’une seule chaîne peptidique et possède trois activités enzymatiques : -Une activité de synthèse ADN polymérase 5’-3’; -Une activité de dégradation exonucléase 3’-5’; -Une activité de dégradation exonucléase 5’-3’.

4-2- L’enzyme de Klenow enzyme obtenu à partir de l’ADN polymérase I d’où l’on a éliminé le petit fragment responsable de l’activité exonucléase 5’-3’. Il ne reste donc plus que les activités polymérase 5’-3’ et exonucléase 3’-5’ 4-3- Les ADN polymérases thermorésistantes La Taq polymérase C’est une ADN polymérase isolée des bactéries vivant dans les sources d’eau chaude. Elle agit à une température voisine de 65°c

4-4- La rétrotranscriptase (ou transcriptase reverse): Codée par les gènes pol des rétrovirus La RT est un enzyme qui permet de fabriquer un ADNc à partir d’un ARNm

Hybridation moléculaire Désigne l'association qui peut avoir lieu entre deux acides nucléiques simples brins de séquences complémentaires et qui conduit à la formation d'un double brin Cette association s'effectue par l'établissement de liaisons hydrogènes spécifiques : deux liaisons entre l'adénine (A) et la thymine (T) (ou l'uracile U) et trois entre la cytosine (C) et la guanine (G) L'hybridation est à la base de nombreuses techniques de biologie moléculaire impliquant la mise en présence d'au moins deux brins simples d'acides nucléiques dans des conditions physico chimiques précises

Les sondes nucléotidiques Une sonde nucléotidique est un segment de nucléotides qui permet de rechercher de manière spécifique un fragment d'acide nucléique que l'on désire étudier Cette réaction sonde-fragment correspond à une réaction d'hybridation moléculaire Une sonde nucléotidique peut être une séquence d'ADN ou d'ARN, mais obligatoirement monobrin Sa taille est très variable : oligonucléotide de 20-30 nucléotides ou à l'opposé de plusieurs centaines de nucléotides La sonde est complémentaire et antiparallèle du fragment recherché. Dans un mélange complexe où s'effectue l'hybridation moléculaire, la sonde doit être facilement repérable grâce à un marquage avec un radioisotope

Les vecteurs Un vecteur est un transporteur capable de conduire une molécule à pénétrer dans une cellule En biologie moléculaire, certains vecteurs sont étudiés pour faire entrer un acide nucléique dans une cellule et permettre la réplication ou l’expression de cet acide nucléique dans la cellule qui le reçoit Les plasmides bactériens, les bactériophages et de nombreux virus sont des vecteurs naturels. D’autres vecteurs encore plus performants ont été obtenus artificiellement à partir de ceux-là grâce à des manipulations génétiques