Nicolas Bertrand & Myriam Baratin De la culture cellulaire à l’expression de protéines impliquées dans la réorganisation du cytosquelette Nicolas Bertrand & Myriam Baratin TD1 Initiation à la culture cellulaire TD2  Les différentes méthodes de transfection cellulaire  Les petites protéines G de la famille Rho TD3  Description des protocoles

Initiation à la culture cellulaire Culture primaire/secondaire Les milieux de culture/maintien des lignées Les paramètres physico-chimiques Matériel et instruments La congélation Les contaminations

1- culture primaire/secondaire C'est une culture de cellules qui proviennent directement d'un tissu. Cette première culture pourra, par la suite, donner lieu à des cultures dites "secondaires«  Traumatisme Contamination Culture secondaire Des cellules ayant une capacité de division non limitée (on parle d'"immortalité en culture"). Ce sont des lignées cellulaires. Les lignées sont soit des cellules cancéreuses, soit des cellules en voie de cancérisation, soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement.

Transformation cellulaire: acquisition de caractères propres à la cellule maligne Autonomie de croissance Perte de l’inhibition de contact Immortalité Indépendance vis-à-vis des facteurs de croissance et des interactions avec la MEC Tumorigénicité chez la souris nude

Immortalisation cellulaire Cellules tumorales Hela: carcinome Raji: lymphome de Burkitt Cellules post-crise Immortalisation spontanée (fibroblastes murins) Cellules immortalisées par l’expérimentateur (expression d’oncogènes viraux, de la télomérase)

How can cells be made immortal How can cells be made immortal? Several methods exist for immortalizing mammalian cells in culture. Viral genes, including Epstein-Barr virus (EBV), Simian virus 40 (SV40) T antigen, adenovirus E1A and E1B, and human papillomavirus (HPV) E6 and E7 can induce immortalization by a process known as viral transformation. Although the process is reliable and relatively simple, these cells may become genetically unstable (aneuploid) and lose the properties of primary cells. For the most part, these viral genes achieve immortalization by inactivating the tumor suppressor genes that put cells into a replicative senescent state. The preferred method to immortalize cells is through expression of the telomerase reverse transcriptase protein (TERT), particularly those cells most affected by telomere length (e.g., human). This protein is inactive in most somatic cells, but when hTERT is exogenously expressed the cells are able to maintain telomere lengths sufficient to avoid replicative senescence. Analysis of several telomerase-immortalized cell lines has verified that the cells maintain a stable genotype and retain critical phenotypic markers.

Cell line Species Cell type Year Estab. MDCK dog kidney 1958 CHO hamster ovary epithelial 1957 CV-1/COS monkey 1964 NIH 3T3 mouse embryo fibroblast 1963 Rat-1 rat 1968 HeLa human cervical carcinoma 1951 HEK-293 embryonic kidney 1977 LNCaP prostate tumor MCF7 mammary tumor 1973

Deux sources de cellules sont possibles : 1 - Les cellules circulantes (en suspension ) sang moelle osseuse liquides physiologiques 2- Cas des cellules à partir de tissus ou d'organes (adhérentes)

Designations: EL4 Depositors:  M Cohn Biosafety Level: 1 Shipped: frozen Medium & Serum: See Propagation Growth Properties: suspension Organism: Mus musculus (mouse) Morphology: lymphoblast Source: Disease: lymphoma Strain: C57BL/6N Cell Type: T lymphocyte; Permits/Forms: In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the specific requirements for shipment to your location. Applications: transfection host (Nucleofection technology from Lonza Roche FuGENE® Transfection Reagents) Antigen Expression: H-2b; Thy-1.2 Cytogenetic Analysis: modal number = 39 Comments: EL4 was established from a lymphoma induced in a C57BL mouse by 9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene. [22448] The cells are resistant to 0.1 mM cortisol and sensitive to 20 mcg/ml PHA. A subline (EL4.IL-2, ATCC TIB-181) that produces high levels of interleukin-2 (IL-2, interleukin 2) is available. Tested and found negative for ectromelia virus (mousepox). Propagation: ATCC complete growth medium: The base medium for this cell line is ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Catalog No. 30-2002. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: horse serum to a final concentration of 10%. Temperature: 37.0°C Subculturing: Medium Renewal: Every 2 to 3 days Cultures can be maintained by addition or replacement of fresh medium. Start cultures at 2 X 10 exp5 cells/ml and maintain between 1 X 10 exp5 and 1 X 10 exp6 cells/ml. Preservation: culture medium 95%; DMSO, 5%

American Type Culture Collection (ATCC) a nonprofit organization in Rockville, Maryland The ATCC Cell Biology Collection is the most comprehensive and diverse of its kind in the world, consisting of over 3,400 cell lines from over 80 different species. It holds over 950 cancer cell lines, 1,000 hybridomas and several special collections including stem cells.

Pourquoi mettre des cellules en culture? Modèle pour l’étude de la physiologie cellulaire Conservation des caractéristiques du tissu initial Accessibilité Contrôle de l’environnement et de traitements appliqués Homogénéité des cellules Matériel en grande quantité

Cycle de croissance d'une lignée cellulaire en culture in vitro Immortalisation cellulaire: Acquisition de la capacité à se multiplier indéfiniment

Culture continue Phase de latence Phase stationnaire Phase exponentielle Nombre de cellules Mort cellulaire Temps (jours) Phase de latence pas de division cellulaire dépend du type cellulaire, du milieu de culture, de la densité cellulaire Phase exponentielle Phase de division cellulaire Temps de doublement selon le type cellulaire (4h à 48h) Phase stationnaire Epuisement du milieu = arrêt de la prolifération Poursuite de la croissance cellulaire (repiquage) ou mort cellulaire

Cellules de mammifères A priori, se rapprocher le plus possible des conditions du milieu intérieur

Reproduction et maintien d’un environnement physiologique Paramètres physiologiques Température 37°C, permissivité faible Ions inorganiques aspect qualitatif et osmolarité pO2 et pCO2 pH 7.2-7.5  Système tampon: HCO3- avec CO2 atmosphérique (5-10%) CO2 + H2O HCO3- + H+ Indicateur coloré: Rouge de Phénol Hygrométrie 85% (évaporation) Lumière visible à éviter

Fourniture d’aliments essentiels Métabolisme énergétique Biosynthèse Catalyse enzymatique (vitamines, oligoéléments) Surface de culture Cas des cellules adhérentes avec dépendance à l’ancrage

Mise à disposition de molécules de transport Pour Hormones Oligoéléments Lipides Mise à disposition de facteurs d’adhérence En fonction de la capacité des cellules utilisées à produire ces facteurs en plus ou moins grande quantité Mise à disposition de molécules informatives Hormones Facteurs de croissance

Reproduire l’environnement physiologique Les milieux La base: milieu synthétique - acides aminés - sels minéraux - NRJ (glucose/glutamine) - Vitamines (fragiles, ne pas autoclaver) Les Suppléments Indéfini: sérum (albumine/transferrine/hormones) extrait de tissus milieu conditionné Défini: Facteurs de croissance Les antibiotiques - Éliminer complètement le contaminant microbien - Ne pas affecter la viabilité ou le métabolisme des cellules - Compatible avec les autres éléments du milieu - Large spectre d’action a . a. e s sen ti e ls be o i n en a. . pour l es ce ll u dan 'o r gan me t en cu lt ur a. syn hé tis és pa de péc li é es dans m donc à j ou g n ne mi yc h d cy st an so eu ci y os euc par ys ac que on phény p in éon tr yptoph va

Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X) liquid (high glucose) Contains 4500 mg/L D-glucose, L-glutamine and 25 mM HEPES buffer but no sodium pyruvate or phenol red. Glycine 75 30 0.4 L-Arginine hydrochloride 211 84 0.398 L-Cystine 2HCl 313 63 0.201 L-Glutamine 146 584 4 L-Histidine hydrochloride-H2O 210 42 0.2 L-Isoleucine 131 105 0.802 L-Leucine L-Lysine hydrochloride 183 0.798 L-Methionine 149 L-Phenylalanine 165 66 L-Serine L-Threonine 119 95 L-Tryptophan 204 16 0.0784 L-Tyrosine disodium salt dihydrate 261 104 L-Valine 117 94 0.803

Vitamins Choline chloride 140 4 0.0286 D-Calcium pantothenate 477 0.00839 Folic Acid 441 0.00907 Niacinamide 122 0.0328 Pyridoxine hydrochloride 206 0.0194 Riboflavin 376 0.4 0.00106 Thiamine hydrochloride 337 0.0119 i-Inositol 180 7.2 0.04 Inorganic Salts Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 111 200 1.8 Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) 404 0.1 0.000248 Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.) 120 97.67 0.814 Potassium Chloride (KCl) 75 400 5.33 Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 84 3700 44.05 Sodium Chloride (NaCl) 58 4750 81.9 Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O) 138 125 0.906 Other Components D-Glucose (Dextrose) 4500 25 HEPES 238 5958 25.03

Technical Resources - Media Formulations Advanced D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (1X) liquid Advanced D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a defined media formulation designed to reduce significantly the amount of serum required for cultivating mammalian cell in vitro. This enhanced standard basal formulation allows for a 50 - 80% reduction in the required serum supplementation with no cell adaptation needed. Suitable for the growth of maintenance of a variety of common cell lines including MDBK Hep-2 COS-7 A549 MDCK WI-38 and others this medium supports cell growth and morpholigical characteristics of both adherent and non-adherent cell lines. It is formulated without L-glutamine for increased stability. Supplementation with L-glutamine is required. Recommended concentration of serum is 1 - 5%; the concentration must be adjusted for each individual cell line to achieve optimal results.

Amino Acids Glycine 75 37.5 0.5 L-Alanine 8.9 ∞ L-Arginine hydrochloride 84 L-Asparagine 13.2 L-Aspartic acid 13.3 L-Cystine 2HCl 63 L-Glutamic Acid 14.7 L-Histidine hydrochloride-H2O 42 L-Isoleucine 105 L-Leucine L-Lysine hydrochloride 146 L-Methionine 30 L-Phenylalanine 66 L-Proline 11.5 L-Serine 52.5 L-Threonine 95 L-Tryptophan 16 L-Tyrosine disodium salt dihydrate 104 L-Valine 94

Vitamins Ascorbic Acid phosphate 2.5 ∞ Choline chloride 4 D-Calcium pantothenate 477 0.00839 Folic Acid 441 0.00907 Niacinamide Pyridoxine hydrochloride Riboflavin 0.4 Thiamine hydrochloride i-Inositol 7.2 Inorganic Salts Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 111 200 1.8 Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) 0.1 Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.) 97.67 Potassium Chloride (KCl) 400 Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 3700 Sodium Chloride (NaCl) 6400 Sodium Phosphate dibasic (Na2HPO4-H2O) 125 Proteins AlbuMAX® II Human Transferrin (Holo) 7.5 Insulin Recombinant Full Chain 10 Trace Elements Ammonium Metavanadate 0.0003 Cupric Sulfate 0.00125 Manganous Chloride 0.00005 Sodium Selenite 0.005 Other Components D-Glucose (Dextrose) 4500 Ethanolamine 1.9 Glutathione (reduced) 307 1 0.00326 Phenol Red 15 Sodium Pyruvate 110

Each Advanced™ medium is the standard published basal formulation, supplemented with NEAA and sodium pyruvate.  We’ve also added these ingredients to allow serum reduction: Ethanolamine Glutathione (reduced) Ascorbic acid phosphate Insulin Human (holo) transferrin AlbuMAX™ (a lipid-rich bovine serum albumin) Trace salts sodium selenite, ammonium matavanadate, cupric sulfate, and manganous chloride

Contaminations Contaminants biologiques Bactéries Levures/moisissures Virus Mycoplasmes Contaminants chimiques Endotoxines Qualité du plastique Reste de détergent Trace d’aluminium Résidus désinfectants Contamination croisée Autres cellules

Mycoplasme Micro-organisme procaryote de type bactérien, dépourvu de paroi rigide (possédant une simple membrane) et capable de multiplication autonome.

Un antibiotique[1] (du grec anti : « contre », et bios : « la vie ») est une substance qui a une action spécifique de bloquage ou même de destruction des bactéries. Pour les autres micro-organismes, on utilise le terme d'« antifongique » s'il s'agit de lutte contre les champignons, ou d'« antiviral » s'il s'agit de lutte contre les virus. Cette substance peut avoir une action toxique directe, c'est-à-dire bactéricide ; son efficacité peut être également limitée à empêcher le développement des micro-organismes (action bactériostatique).

Antibiotiques doivent: Eliminer complètement le contaminant microbien Beta-lactamine Beta-lactamine Aminoside Antibiotiques doivent: Eliminer complètement le contaminant microbien Ne doivent pas affecter la viabilité ou le métabolisme des cellules Compatible avec les autres éléments du milieu Large spectre d’action

Les pénicillines sont des antibiotiques bêta-lactamines Les pénicillines sont des antibiotiques bêta-lactamines. À la base, la pénicilline est une toxine qui provient de la moisissure penicillium provenant du champignon Penicillium notatum et qui est inoffensive pour l'homme. Les pénicillines ont pour formule chimique : R-C9H11N2O4S où R est une chaîne variable. Les pénicillines A sont des aminopénicilline à spectre élargi. L'ampicilline et surtout l'amoxicilline sont ses deux principaux représentants. Pénicilline G Les pénicillines et les autres antibiotiques β-lactames agissent par inhibition de la formation des liens inter-peptidoglycanes dans la paroi cellulaire bactérienne. La moitié bêta-lactame des pénicillines se lie à l'enzyme (transpeptidase) qui devrait se lier aux molécules de peptidoglycane des bactéries et empêche ainsi la multiplication des bactéries.

La streptomycine est un antibiotique antibactérien cytostatique et cytotoxique. Il appartient à la classe des aminosides (ou aminoglycosides) Il fut isolé à partir d'une souche d'actinobactérie Streptomyces griseus Action par fixation sur la petite sous-unité des ribosomes eubactériens: synthèse protéique aberrante. Effet bactéricide. Le spectre d'action de la streptomycine est assez large puisqu'elle peut agir sur certains bacilles gram négatifs (comme Escherichia coli) ou certains cocci gram positifs (comme le Staphylococcus aureus). Cet antibiotique agit également sur Mycobacterium tuberculosis, et fut d'ailleurs le premier antibiotique contre la tuberculose.

La tétracycline est un antibiotique produit par une bactérie du genre Streptomyces. Elle est indiquée contre nombre d'infections bactériennes. La tétracycline empêche la fixation de l'aminoacyl-ARNt entrant dans le site A du ribosome. Effet bactériostatique. Spectre : bactéries Gram positif et Gram négatif

Matériel et instruments

Matériel et instruments

Matériel et instruments

Matériel et instruments

NON!!!

Matériel et instruments PSM: Poste de Sécurité Microbiologique (de type II) Ne pas introduire trop d'objets  perturbe le flux & la sécurité manipulateur Ne pas introduire d'objet poussiéreux  colmate le filtre Ne pas tousser, ni éternuer en direction de la zone stérile Procéder à la désinfection alors qu'elle est toujours en marche Ne pas effectuer de mouvements rapides à l'intérieur de l'enceinte stérile L'emploi de source de chaleur dans l'enceinte est interdite Il est interdit d'introduire la tête dans la zone stérile

Matériel et instruments Microscope inversé à contraste de phase

Matériel et instruments

Matériel et instruments

Matériel et instruments Étuve à CO2

Technique Aseptique pour culture cellulaire Hygiène: cheveux attaches Se laver les mains avant après. Port de gants blouse Ethanol 70% mais attention à la perméabilité La peau contient naturellement des bactéries et des champignons qui adorent les milieux de culture Tout ce qui est en contact avec la culture doit être stérile flasques pipettes Environnement: PSM poste de sécurité microbiologique Nettoyage des hottes: TFD7 ou RBS détergent désinfectant Eau Ethanol Nettoyer les flacons à mettre sous la hotte

Congélation/Décongélation Buts Préserver Éviter sénescence Limiter risque de contamination Minimiser les variations génétiques (perte ou doublement des chromosomes) Agents cryo-protecteurs DMSO Glycérol Quand/Comment Phase exponentielle, suspension entre 106 et 108 cellules par mL On congèle dans le milieu complet Temps d’équilibration avec les cryoprotecteurs à la température du laboratoire Congélation graduelle à -40°C/-80°C lentement (1 ou 4°C par min) puis dans l’azote liquide (-196°C) Décongélation rapide à 37°C suivie d'un lavage et d'un contrôle de viabilité Pendant ces phases, on limite les autres stress appliqués aux cellules

Fourchette de température critique -15°C/-60°C Jusqu’à -5°C, pas de congélation du milieu ni des liquides intracellulaires Entre -5°C et -15°C, le milieu commence à congeler mais pas les liquides intracellulaires conséquence: les cellules se déshydratent (l’eau intracellulaire sort) Le refroidissement lent permet une déshydratation efficace et limite la congélation intracellulaire qui entraîne la mort de la cellule. Plus les cellules sont grandes et plus le refroidissement en général doit être lent. Cette première condition doit être remplie mais n’est pas suffisante. En effet, il semble que les changements de forme induit par la perte d’eau et ceci en présence de quantité de glace extracellulaire croissantes sont anisotropes (distorsion), ce qui provoquerait des lésions cellulaires. D’autre part, l’augmentation de concentration des solutés serait aussi délétère. Le refroidissement est lent, on augmente la durée d’exposition aux forces de distorsion. Les agents cryoprotecteurs agiraient en diminuant le problème: ils permettent d’augmenter la fraction non congelée et donc limite la déshydratation et l’action des forces de distorsion. La vitesse de décongélation est importante aussi. En général, une décongélation et un réchauffement trop lent sont délétères pour la survie des cellules.