Les approches protéomiques AEB2011 Marc Bonneu ESTBB 2008

Plan 1-Séparation des protéines par électrophorèse 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Carte peptidique Séquençage peptidique 3-Quantification des protéines Comparaison gel 2D Marquage isotopique Label Free 4-Caractérisation des protéines Interactions protéine-protéine Modifications post-traductionnelles

1-Séparation des protéines par électrophorèse SDS-PAGE Avantage : toutes les protéines y compris les protéines membranaires Inconvénient : Plusieurs protéines dans la même bande Les petites protéines migrent toutes ensemble au niveau du front de migration

1-Séparation des protéines par électrophorèse Tris-Tricine Remplacement de la glycine par un tripeptide de glycine (Tricine) Petites protéines emprisonnées dans des micelles de SDS 4

1-Séparation des protéines par électrophorèse IPG/SDS-PAGE pI Avantages : Excellente résolution Les limites : Protéines majeures Protéines solubles 4 < pI <11 15 000 Da < PM < 150 000 Da taille

1-Séparation des protéines par électrophorèse 16-BAC/SDS-PAGE 16-BAC (benzyldimethyl-n-hexadecylammonium chloride) 16-BAC Détergent cationique SDS Avantages : Séparation des protéines hydrophobes possible Les limites : Résolution réduite

1-Séparation des protéines par électrophorèse La détection des protéines sur gel 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1: 1000 ng/ protéine 2: 500 ng/ protéine 3: 250 ng/ protéine 4: 125 ng/ protéine 5: 62.5 ng/ protéine 6: 31.25 ng/ protéine 7: 15.6 ng/ protéine Coomassie R250 Nitrate d’argent Bleu Colloïdal 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Ruthenium 16µl/L SyproRuby ProQ diamond

1 ordre + prot spécifique 1-Séparation des protéines par électrophorèse La détection des protéines sur gel Limite de détection Gamme dynamique Coloration au bleu de Coomassie 500 ng 1 ordre Coloration au bleu de Coomassie colloïdal classique 100 ng 2 à 3 ordres Coloration au bleu de Coomassie colloïdal rapide 20 ng Coloration au nitrate d’argent 10 ng 1 ordre + prot spécifique Coloration au nitrate d’argent non compatible avec la masse 1 ng SyproRuby®, DeepPurple®, Ruthénium 3 ordres Marquage radioactif 0.000 2 ng excellente La gamme dynamique est définie comme le rapport du signal maximal mesurable sur le signal minimal mesurable

2-Identification des protéines par spectrométrie de masse gène Spectromètre de masse : mesure précise du rapport m/z d’un ion H+ Spectromètre de Masse m : masse de l’ion z : valence de l’ion peptide ou protéine ion m/z unité : Thompson Ionisation Analyse en m/z

+ + ++ + 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Pourquoi le spectromètre de masse mesure le rapport m/z ? + H+ = 1 Da Champ électrostatique Vide suffisant 1000 + 1 + m = 1000 Da m/z = = 1001 1 1000 + 2 ++ m = 1000 Da m/z = = 501 2 + 2000 + 1 m = 2000 Da m/z = = 2001 1 10

2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? H+ = 1 Da 501 1000 + 1 2001 m/z = = 1001 1 1001 1000 + 2 m/z = = 501 2 2000 + 1 m/z = = 2001 1 11

2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? H+ = 1 Da 501 1000 + 1 2001 m/z = = 1001 1 1001 1000 + 2 m/z = = 501 2 2000 + 1 m/z = = 2001 1 12

2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? H+ = 1 Da 501 1000 + 1 2001 m/z = = 1001 1 1001 1000 + 2 m/z = = 501 2 2000 + 1 m/z = = 2001 1 Le massif isotopique 13

x 12C 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? x 12C (x-1) 12C + 1 13C La différence de masse entre deux pics successifs d’un massif isotopique est égale à 1Da (x-2) 12C + 2 13C Le massif isotopique 14

2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? x 12C (x-1) 12C + 1 13C La différence de masse entre deux pics successifs d’un massif isotopique est égale à 1Da (x-2) 12C + 2 13C a Th a Th 15

x 12C a Th a Th a = 1  z = 1 a = 0.5  z = 2 a = 0.33  z = 3 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? x 12C (x-1) 12C + 1 13C La différence de masse entre deux pics successifs d’un massif isotopique est égale à 1Da (x-2) 12C + 2 13C a Th a Th a = 1  z = 1 a = 0.5  z = 2 a = 0.33  z = 3 16

Spectre MS expérimental Peptides générés in silico 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Carte peptidique Peptides générés par protéolyse Spectre MS expérimental Protéine à identifier m/z I K R K K K R Comparaison Séquences des protéines Peptides générés in silico Spectres MS théoriques YILMNPRTHSEIKNPMLKLLIHGFDSQASDRTFGNHGGTKTRFDFEEKMLIYTRNVCWCHGFPITREAESDD LKLLIHGFDSQASDR FGNHGGTK TRFDFEEK YILMNPR THSEIK m/z I

2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Séquençage peptidique Protéine Peptides générés par protéolyse Spectre MS expérimental Spectre MS2 expérimental m/z I K R I m/z Comparaison Séquences des protéines Peptides générés in silico Spectres MS2 théoriques YILMNPRTHSEIKNPMLKLLIHGFDSQASDRTFGNHGGTKTRFDFEEKMLIYTRNVCWCHGFPITREAESDD LKLLIHGFDSQASDR FGNHGGTK TRFDFEEK YILMNPR THSEIK m/z I

2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Identification des protéines dans un mélange complexe Digestion in-gel découpage Identification par spectrométrie de masse LC/MS/MS Compilation et élimination de la redondance

2-Identification des protéines par spectrométrie de masse dénaturation trypsine Protéines Peptides 24 cm Strip IPG pH 3.5 pH 10 électrophorèse 32 morceaux Compilation et élimination de la redondance Identification par spectrométrie de masse LC/MS/MS

Attention à l’overlapping 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Identification systématique des protéines d’un protéome Digestion in-gel Identification par MS Carte peptidique séquence peptidique Rapide Peu coûteux Attention à l’overlapping

synthèse abondance dégradation modification 3-Quantification des protéines Comparaison de l’abondance des protéines entre des états physiologiques différents synthèse abondance dégradation synthèse abondance dégradation modification modification Quantification relative par électrophorèse Quantification relative spectrométrie de masse Marquage isotopique SILAC ICAT iTRAQ Label Free Quantification absolue par spectrométrie de masse

3-Quantification des protéines Quantification relative par électrophorèse bidimensionnelle F1 F2 Identification par MS Carte peptidique Séquence peptidique

3-Quantification des protéines La spectrométrie de masse n’est pas quantitative I m/z MS p Peptides équimolaires 1 Protéine Digestion

3-Quantification des protéines La spectrométrie de masse n’est pas quantitative et pourtant … I m/z MS p Peptides équimolaires 1 Protéine Digestion Peptide p 14N Peptide p 15N 1:10 1:1 1:2 I I I MS MS MS m/z m/z m/z 25

3-Quantification des protéines La comparaison par marquage isotopique et analyse MS SILAC ICAT iTRAQ Digestion trypsique échantillon protéine peptide Spectrométrie de masse Marquage isotopique

3-Quantification des protéines iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification H3C N O Groupement réactif H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-… R1 R2 reporter balance 114 31 + 145 115 30 + 145 116 29 + 145 117 28 + 145

3-Quantification des protéines iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification Marquage iTRAQ 114 protéine protéolyse t0 T0+20 min iTRAQ 115 T0+40 min iTRAQ 116 T0+60 min iTRAQ 117 Mélange

3-Quantification des protéines iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification MS intensité peptide balance reporter 114 31 m/z MS/MS peptide balance reporter 115 30 intensité peptide balance reporter 116 29 m/z peptide balance reporter 115 116 117 28 intensité 117 114 m/z

3-Quantification des protéines Label Free LC/MS/MS C18 quantité temps de rétention intensité m/z MS

Même temps de rétention 3-Quantification des protéines Label Free MS MS MS MS intensité m/z m/z m/z m/z intensité Même temps de rétention

3-Quantification des protéines Label Free Échantillon 1 intensité Même temps de rétention Échantillon 2 intensité Même temps de rétention

3-Quantification des protéines La quantification absolue : AQUA® Protéines dont protéine P à doser protéolyse Peptides dont peptide p de la protéine p Peptide p marqué par un isotope stable (quantité connue) Analyse par LC/MS/MS Peptide p Peptide p AQUA® MS m/z

post-traductionnelle 3-Caractérisation des protéines Complexe protéique Modification post-traductionnelle Agglomérats

3-Caractérisation des protéines Complexe protéique Le système double hybride Blue Native / SDS-PAGE Co-immunoprécipitation Far Western Purification : -Pull down -Purification des interactants par chromatographie d’affinité -Co-purification : TAP-tag Puce à protéine Phage display Complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) Transfert d’énergie de fluorescence par résonance Résonance plasmonique des surfaces

Le système double hybride 3-Caractérisation des protéines Le système double hybride TA DB Gal4p active la transcription de GAL1 et GAL10 Gal4p TA DB promoteur reporteur signal 36

Le système double hybride 3-Caractérisation des protéines Le système double hybride TA Y Y + X X DB promoteur reporteur signal 37

3-Caractérisation des protéines BN-PAGE SDS-PAGE 1ère dimension Bleu de Coomassie Gradient 2ème dimension Équilibration SDS Mercaptant dessalage Détergent neutre Complexes membranaires Complexes cytosoliques pH Principe BN/SDS-PAGE 38

3-Caractérisation des protéines 4% 18% 7% 12 % complexes hétéromultimériques cytosoliques 39

Anticorps spécifique de Identification par spectrométrie de masse 3-Caractérisation des protéines La co-immunoprécipitation + Protéine A sépharose Anticorps spécifique de Extrait SDS-PAGE Identification par spectrométrie de masse 40

Identification par spectrométrie de masse 3-Caractérisation des protéines Le Pull Down GST GST GST GST + Glutathion sépharose GST GST GST lysat SDS-PAGE GST Identification par spectrométrie de masse Glutathion sépharose GST GST GST Variantes : -fixation préalable de la protéine de fusion sur la colonne de Glutathion séparose -autres étiquettes : 6His, Streptavidine, HaloTag, … 41

NHS activated sepharose™ Identification par spectrométrie de masse 3-Caractérisation des protéines La purification des interactants par chromatographie d’affinité lysat NHS activated sepharose™ SDS-PAGE Identification par spectrométrie de masse 42

3-Caractérisation des protéines La co-purification : TAP-Tag Calmoduline Binding Peptide Site de clivage de la protéase du TEV Protéine appât Fragment ZZ de la protéine A 2 IgG Sepharose CalmodulineSepharose 3 1 43

M13 avec PIII rec ou PVIII rec 3-Caractérisation des protéines Le phage display Banque de phage M13 avec PIII rec ou PVIII rec Sélection Lavage Elution Amplification et re-sélection 44

3-Caractérisation des protéines Le Far Western Découpage de la zone Transfert sur membrane Renaturation Incubation avec la protéine appât Incubation avec l’anticorps dirigé contre la protéine appât Révélation avec un anticorps secondaire Identification par spectrométrie de masse 45

3-Caractérisation des protéines Complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) Protéine A Linker NYFP 1 154 Protéine B Linker CYFP 155 233 46

3-Caractérisation des protéines Transfert d’énergie de fluorescence par résonance FRET X Y X Y

Unité de détection optique 3-Caractérisation des protéines Résonance plasmonique des surfaces Canal Puce avec film d’or Lumière polarisée Prisme Lumière réfléchie Unité de détection optique Source de lumière Angle Intensité

3-Caractérisation des protéines Puce à protéine

3-Caractérisation des protéines Agglomérats Problème récurrent en bioproduction Mise au point du process de production Mesure de la masse du produit purifié

post-traductionnelle 3-Caractérisation des protéines Mesure de masse exacte de la protéine Exemple : Masse mesurée = 65 864,338 Da Masse calculée = 65 928,435 Da Modification post-traductionnelle D masse = + 64,097 +58 Carboxymethyl (on Cysteine) +60 sodium + potassium +64 Selenocysteine (from Serine) +67 Asp transamidation with piperidine +68 3,5-Dichlorination (of Tyrosine with 35Cl)

post-traductionnelle 3-Caractérisation des protéines protéolyse MS fragmentation MS2 Modification post-traductionnelle MS4 MS3

Merci de votre attention