Année universitaire: 2015-2016 Projet de fin d’études Estimation de l’incertitude de mesure en microbiologie agroalimentaire dans la matrice : l’eau Encadré par : Dr. EL MADOUDI MOHAMED Prof. BOUHDID SAMIRA Présenté par : ZOUAKI KHADIJA Année universitaire: 2015-2016

Plan Introduction Objectif de l’étude Contrôle des milieux de culture Evaluation de la membrane filtrante Evaluation d’incertitude de mesure Discussion des résultats Conclusion et perspective

Introduction

L’eau Est une ressource indispensable à la vie. Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Est une ressource indispensable à la vie. L’eau Essentielle pour de multiples usages (domestiques, industriels et agricoles)

Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif L’eau potable Est une eau qu’on peut consommer sans risque sanitaire, et qui est agréable à boire.

L’eau potable Norme Marocaine 03.7.001 La potabilité de l’eau Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif L’eau potable Norme Marocaine 03.7.001 La potabilité de l’eau microbiologique Physico-chimique Organoleptique - Couleur - Turbidité - odeur - Saveur - Des substances chimiques à des teneurs limitées. PH Conductivité Température , etc. Indemne d’agents pathogènes ( virus, bactéries, parasites, etc. )

Bactéries indicatrices de la qualité de l’eau Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Bactéries indicatrices de la qualité de l’eau Spécifique au contamination fécale, absentes dans un environnement non-pollué. bons indicateurs d’efficacité de traitement Facile à détecter à l’aide des tests simples

L’eau potable Selon la norme marocaine 03.7.001 Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif L’eau potable Selon la norme marocaine 03.7.001 Les indicateurs de la contamination de l’eau Escherichia Coli Entérocoques Coliformes totaux Spore de m-o sulfito réducteur Germes revivifiables à 22°C et à 36°C VMA = 0UFC/100ml VMA = 0UFC/100ml VMA = 0UFC/100ml VMA = 0UFC/100ml 22°C VMA = 100 UFC/1ml 37°C VMA = 20 UFC/1ml VMA : Valeur maximale admissible

L’approvisionnement de l’eau potable au MAROC Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif L’approvisionnement de l’eau potable au MAROC Zone urbain Zone rural L’ accès de l’eau potable est généralisé L’accès de l’eau potable est non généralisé

L’eau brute Eau qui n’a pas subie aucun traitement Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif L’eau brute Eau qui n’a pas subie aucun traitement Figures : Points d’eau traditionnels

Objectif

Analyse bactériologique de l’eau brute Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Analyse bactériologique de l’eau brute Recherche des bactéries indicatrices de la contamination fécale Coliformes totaux Coliformes fécaux, E . Coli Entérocoques intestinaux Streptocoque fécaux

Fermentent le lactose à 37°C Coliformes totaux Ils se répartissent en deux catégories  Les germes d’origine fécale stricte  Les germes provenant d’autre sources environnementales (aquatique et tellurique) Fermentent le lactose à 37°C Oxydase -

Fermentant lactose à 44°C Coliformes fécaux Coliformes fécaux font partie du groupe des coliformes totaux. Abondants dans les intestins des mammifères et des êtres humains. Fermentant lactose à 44°C Oxydase -

Fermentant lactose à 44°C Escherichia Coli La bactérie Escherichia coli est abondante dans la flore intestinale des humains et des animaux . la seule espèce qui est strictement d’origine fécale. Fermentant lactose à 44°C Oxydase – Indole +

Entérocoques intestinaux Streptocoques fécaux Groupe de bactéries naturellement présentes dans la flore intestinale des humains et des animaux Ces bactéries sont considérées comme indicatrices d’une contamination d’origine fécale.

Entérocoques intestinaux Streptocoques fécaux Résistance des Entérocoques Résistance des coliformes Capables de pousser sur des géloses biliée Hydrolysent l’esculine

Risque de présence de microorganismes pathogènes Contamination d’origine fécale Maladies hydriques Diarrhée aigue le choléra  vibrio cholerae la fièvre typhoïde  Salmonella typhi Dysenterie bacillaire   shigella

La norme marocaine ISO 7218 La présente Norme décrit des exigences techniques avant de commencer les analyses : Contrôle de performance des milieux de culture suivant la norme marocaine ISO TS 11133-2 Évaluation de membrane filtrante suivant la norme marocaine ISO 7704 ISO: International Standard Organisation

Contrôle qualité des milieux de culture

Les milieux de culture TTC Tergitol 7 SLANETZ Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Les milieux de culture TTC Tergitol 7 SLANETZ

Préparation des milieux de culture et des bouillants Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Préparation des milieux de culture et des bouillants Figure: Étapes de préparation des milieux de culture

CONTRÔLE QUALITE des milieux de culture Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif CONTRÔLE QUALITE des milieux de culture Contrôle physicochimique -L’aspect de poudre. -La dissolution de la poudre dans l’eau ou bain marie. -Le pH. -Aspect du milieu préparé. -Couleur de milieu préparé. Contrôle bactériologique Contrôle de stérilité = ‘’ Témoin ’ , Productivité Contrôle de fertilité Sélectivité

Les résultats du contrôle physico-chimique Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Les résultats du contrôle physico-chimique Milieux Aspect de la base déshydraté La dissolution de la poudre dans l’eau ou bain marie pH Aspect du milieu préparé Couleur de milieu préparé TTC Tergitol 7 poudre beige à verdâtre, fluide et homogène Rapide 7,3 Solide vert Slanetz poudre blanc crème, fluide et homogène Rapide 7,2 Solide gélose ambrée à rose

Les résultats du contrôle de productivité Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Les résultats du contrôle de productivité TTC Tergitol 7 SLANETZ et BARTLEY

Les résultats du contrôle de sélectivité Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Les résultats du contrôle de sélectivité TTC Tergitol 7 SLANETZ et BARTLEY

Les résultats du contrôle qualité des milieux de culture Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Les résultats du contrôle qualité des milieux de culture Le contrôle physico-chimique est conforme Le contrôle bactériologique est conforme Donc les milieux de culture , répondent au normes en vigueur

Evaluation de la membrane filtrante

45 la membrane filtrante Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif la membrane filtrante 45

La filtration sur membrane Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif La filtration sur membrane La filtration sur membrane est une technique adaptée pour énumérer les bactéries dans l'eau en analysant des volumes d’eau importants. Figure: Méthode de filtration sur membrane

L’ évaluation de la membrane filtrante Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif L’ évaluation de la membrane filtrante la norme marocaine ISO 7704

L’ évaluation de la membrane s’effectue suivant cinq étapes: Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif L’ évaluation de la membrane s’effectue suivant cinq étapes: Préparation de la suspension mère. Préparation des dilutions de la suspension mère. Etalement sur le milieu TTC Tergitol 7. Filtration sur membrane. Comparaison des résultats.

Préparation de la suspension mère Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Préparation de la suspension mère 1

Préparation des dilutions Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Préparation des dilutions

La dilution 10-6 sera utilisée pour évaluer la membrane filtrante. Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif La dilution 10-6 sera utilisée pour évaluer la membrane filtrante. 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

Etalement sur milieu solide Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Etalement sur milieu solide

Filtration sur membrane Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Filtration sur membrane

Résultats de l’ évaluation de la membrane Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Résultats de l’ évaluation de la membrane Colonies sur membrane 80 à 90% des colonies sur TTC La membrane filtrante répond aux normes en vigueur.

Modes opératoires des analyses microbiologiques de l’eau

Préparation des dilutions décimales Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Préparation des dilutions décimales 

Déposer la membrane sur une boite de TTC Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Mode opératoire de la recherche et le dénombrement des coliformes totaux et des coliformes fécaux Selon la NM ISO 9308-1 Filtration de 100 ml d’eau Déposer la membrane sur une boite de TTC Incuber à 37°C – 24h Pour le dénombrement des coliformes totaux Incuber à 44°C -24h Pour le dénombrement des coliformes fécaux

Colonies caractéristiques sur TTC Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Colonies caractéristiques sur TTC Repiquage sur le milieu nutritif TSA Incubation à 37°C – 24 h

Confirmation des coliformes totaux Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Confirmation des coliformes totaux Test oxydase Etapes de confirmation des coliformes totaux Les coliformes totaux sont à oxydase négatif

Confirmation des coliformes fécaux Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Confirmation des coliformes fécaux Bouillant BLBVB Etapes de confirmation des coliformes fécaux Les coliformes fécaux = Milieu trouble + production de gaz sous la cloche.

Confirmation des Escherichia coli Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Confirmation des Escherichia coli Test d’indole 0,5 ml dans les tubes à hémolyse + Colonies Incubation à 37°C 24h Etapes de confirmation d’Escherichia coli Escherichia coli = apparition d’anneau rouge.

Déposer la membrane sur la gélose Slanetz Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Mode opératoire de la recherche et le dénombrement des entérocoques intestinaux et des streptocoques fécaux NM ISO 7899 Filtration de 100 ml d’eau Déposer la membrane sur la gélose Slanetz Incubation à 37°C – 24 h

Confirmation des entérocoques intestinaux Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Confirmation des entérocoques intestinaux Transférer la membrane, avec toutes les colonies, sur la gélose BEA. Incubation 2 h – 44°C Entérocoques intestinaux = l’apparition des taches noires

Confirmation des streptocoques fécaux Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Confirmation des streptocoques fécaux Repiquer les colonies caractéristiques dans le bouillant de Litsky Incubation pendant 24h à 37°C. Streptocoques fécaux = l’apparition d’un dépôt violet

Les point d’eau analysées

Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Figure: Résultats d’analyses microbiologiques des quatre sites

Discussion des résultats

GEZNAYA - Influencée par les eaux de surface - Source sans protection Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif GEZNAYA - Influencée par les eaux de surface - Source sans protection - Absence d’hygiène

AGLA - États physique défectueux - Absence d’hygiène Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif AGLA - États physique défectueux - Absence d’hygiène

RMILAT Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif RMILAT

KHANDAGOUR Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif KHANDAGOUR La source d’origine

Pas de risque direct pour la santé Coliformes totaux Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Pas de risque direct pour la santé Coliformes totaux Possibilité de présence des microorganismes pathogènes Coliformes fécaux Maladies hydriques Streptocoques et entérocoques Infections

Conclusion et perspective

Risque pour la santé du consommateur Mauvaise qualité Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif L’eau brute de ces sources est contaminée sur le plan bactériologique donc, elle est hors norme. Risque pour la santé du consommateur Mauvaise qualité

Analyses bactériologiques et physico-chimiques . Contrôle qualité des milieux Evaluation de la membrane Analyses des échantillons Discussion Conclusion perspective Introduction Objectif Analyses bactériologiques et physico-chimiques . Prélèvements sur différente périodes de l’année. Réaménager ces sources. Procéder à des contrôles périodiques de ces sources . Effectuer des traitements périodiques. Sensibiliser les utilisateurs par panneaux.  

Merci pour votre attention