Méthodes physico-chimiques d’étude des molécules biologiques L2 BBTE – 144EN006 Méthodes physico-chimiques d’étude des molécules biologiques 1- Méthodes de fractionnement 2- Méthodes de caractérisation Pamela Pasetto pamela.pasetto@univ-lemans.fr laboratoire IMMM, 4ème étage bâtiment Chimie, bureau 173

Planning UMPCEMB13 7 séances COURS (4 séances de 2h) + Travaux dirigés ( 3 séances de 2h, 1 seul groupe TD) DS1 1 heure DS2 1h30 TP 4 séances de 4 heures David Bruant clé d'inscription UMTICE UMPCEMB13

Livres à consulter « Chimie Analytique », Skoog, West, Holler, Ed. De Boeck (traduction 7ème édition américaine) « Analyse Chimique. Méthodes et techniques instrumentales modernes »; Rouessac, Ed. Dunod, 2000. R. M. Silverstein, G. C. Bassler et T. C. Morrill, dans "Identification spectrométrique de composés organiques", Traduction française de la 5ième Édition par E. Larue, DeBoeck Université, Paris, 1998 « Abrégé de chimie analytique » tome 2, Méthodes de séparation  G. Mahuzier, M. Hamon,2e éd. rév. et augm., Masson, 1986 « Analytical Chemistry », Kellner, Mermet, Otto, Widmer Ed. Wiley, 1998 (anglais)

1- Méthodes de fractionnement 2- Méthodes de caractérisation Objectif du cours 1- Méthodes de fractionnement 2- Méthodes de caractérisation Cours de chimie mais pas de réactions ni de mécanismes On parle des méthodes pour séparer les composés Et des instruments: techniques analytiques qu’on utilise pour les reconnaitre (= pour identifier la structure chimique des molécules) menthe poivrée exemple extraction 1) Séparation 2) Analyses menthol

1- Méthodes de fractionnement Filtration Sédimentation Dialyse et Électrodialyse L‘électrophorèse La chromatographie

Méthodes de fractionnement I- Filtration Définition Séparation de particules en suspension dans un fluide par différence de pression à travers une membrane Différents types de filtrations Classement selon: La taille des particules séparées La micro-filtration (particules voisines du mm) L‘ultra-filtration (macromolécules) La technique de filtration Filtration gravimétrique Filtration sous vide (pression réduite) Filtration sous pression

Usine de désalinisation qui utilise, entre autres, la microfiltration Usine de désalinisation qui utilise, entre autres, la microfiltration. © Roplant http://www.aquasource-membrane.com/-procede-filtration-eau-.html

Exemple: filtration de l’eau potable

1) la filtration par gravité: le mélange est soumis uniquement à la pression atmosphérique. Le liquide passe à travers le support filtrant (papier/sable/plastique) tandis que le solide est récupéré sur le support filtrant. 2) la filtration sous pression réduite: le mélange est soumis d’un côté du filtre à la pression atmosphérique, et de l’autre côté, où sort le filtrat, à une dépression réalisée grâce à une pompe à vide. Filtre par gravité auto lavant (1100 m³/h) Filtration sous pression réduite/sous vide

3) la filtration par surpression la suspension arrive sous pression dans le filtre (pompe) Exemple: le système fermé de filtration à pression permet de nettoyer biologiquement et mécaniquement l'eau du bassin

Méthodes de fractionnement I- Filtration Applications Clarification d‘un liquide Isolation d‘un solide Les Filtres Insolubles et inertes physiquement et chimiquement On distingue: Les filtres d‘épaisseur Les textiles (gaze, laine , coton) Les fibres (laine de verre, papier) Les terres infusoires, les argiles et porcelaines et les verres frittés Les membranes (forte densité de pores ~ 1010/cm²)

Méthodes de fractionnement II- Sédimentation Centrifugation / Ultra-Centrifugation Séparation de particules en fonction de leur sédimentation Cette sédimentation est due à: Les forces auxquelles les particules en suspension sont soumises Une accélération centrifuge élevée La centrifugation L‘ultra-centrifugation La vitesse de sédimentation dépend: De la vitesse de rotation du rotor Du rayon de centrifugation De la différence entre les masses volumiques Du coefficient de viscosité et de la géométrie des molécules dispersées

Centrifuge ω r rotor Axe de rotation Pour chaque utilisation on doit programmer: Vitesse (rpm) Temps (minutes) Température (°C)

Forces auxquelles est soumise une particule en suspension dans un liquide Avant centrifugation pendant centrifugation Poussée Archimède Force gravité frottement Force centrifuge Agitation moléculaire

Méthodes de fractionnement II- Sédimentation Constante de sédimentation (s) s =Vitesse de sédimentation ramenée à l‘unité d‘accélération Caractéristique de la particule dispersée S‘exprime en secondes dans le S.I. (10-13 s = 1 Svedberg) Applications Séparation de mélanges Caractérisation des macromolécules Détermination des masses molaires Vérification de la pureté d‘un extrait

Consignes sécurité à respecter… avant après The Cornell Accident Ne pas dépasser vitesse maximale conseillée Équilibrer le poids des tubes Considérer âge rotor

Méthodes de fractionnement III- Dialyse et Électrodialyse Définition Séparation des ions ou molécules de petite taille des macromolécules par le passage à travers une membrane poreuse

III- Dialyse La membrane doit: Avoir une grande surface Être de faible épaisseur (20 mm) Avoir des pores de diamètre calibré (15-50 Å pour 3.5K, 7K,10K MWCO)

Théorie de la dialyse Elle est complexe et fait appel à: La loi de Fick (diffusion libre) Le flux de substance diffusée (dm/dt) est proportionnel au gradient de concentration (dC/dx) et à la surface S La loi de diffusion à travers une membrane Pris en compte de l‘effet de tamis, des phénomènes électrostatiques et de l‘adsorption de certains solutes sur la membrane Variation locale des concentrations

Méthodes de fractionnement III- Dialyse et Électrodialyse Définition Séparation des ions ou molécules de petite taille des macromolécules par le passage à travers une membrane Théorie de la dialyse Elle est complexe et fait appel à: La loi de Fick (diffusion libre) La loi de diffusion à travers une membrane La pression osmotique la pression osmotique est proportionnelle à la concentration du soluté et à la température

Méthodes de fractionnement III- Dialyse et Électrodialyse Définition Séparation des ions ou molécules de petite taille des macromolécules par le passage à travers une membrane Théorie de la dialyse Elle est complexe et fait appel à: La loi de Fick (diffusion libre) La loi de diffusion à travers une membrane La pression osmotique Bilan: définition du coefficient de dialyse La vitesse de dialyse dC/dt est proportionnelle à la concentration C de la solution Le coefficient de proportionnalité est le coefficient de dialyse

Électrodialyse Un champ électrique accélère le mouvement des ions Appareillage:  Membranes anioniques (perméables aux anions)  Membranes cationiques (perméables aux cations) Inconvénients:  Variation du pH  Élévation de la T°C Élimination plus complète et plus rapide Dénaturation des biomolécules

Méthodes de fractionnement III- Dialyse et Électrodialyse Applications Préparatives Purification d‘un produit Concentration d‘un échantillon Analytiques Détermination des constantes d‘affinité Détermination du nombre de sites actifs Industrielles Sucrerie Industrie pharmaceutique

Application électrodialyse: Dessalement eau mer cathode anode La technique de l'électrodialyse permet d’extraire les ions d'une solution en les déplaçant. Dans le cas de l'eau de mer, on peut extraire les ions Na+ et Cl- grâce à un appareil que l'on appel électrodialyseur

Méthodes de fractionnement IV- L‘électrophorèse Définition Méthode de fractionnement et d‘analyse Basée sur la migration différentielle des particules électriquement chargées, soumises à un champ électrique Technique très utilisée et ce dans de nombreux domaines Facteurs dont dépend la migration La nature de la molécule (charge électrique globale, taille et forme) La nature du tampon pH (électrophorèse de zone ou à pH basique) Force ionique Viscosité

Méthodes de fractionnement IV- L‘électrophorèse Facteurs dont dépend la migration (suite) La nature du support Propriétés adsorbantes Texture Réticulation Les conditions opératoires Temps de migration Température Intensité du courant électrique

Méthodes de fractionnement IV- L‘électrophorèse Les différents supports Électrophorèse sur papier (protéines, petites molécules) Électrophorèse sur acétate de cellulose (protéines) Électrophorèse sur gel d‘agarose (acides nucléiques, protéines) Électrophorèse sur gel de polyacrylamide Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate P.A.G.E (protéines, acides nucléiques) S.D.S - P.A.G.E (protéines, acides nucléiques)

Méthodes de fractionnement IV- L‘électrophorèse Les différents moyens de révélation Colorants spécifiques Protéines: ninhydrine, noir amidé, rouge Ponceau, vert de lissamine, amido-schwarz, … Acides nucléiques: bromure d‘éthidium Lecture densimétrique Révélations spécifiques Glycoprotéines: réactif de Schiff Lipoprotéines: noir Soudan, rouge Ciba Enzymes: réaction spécifique Réaction antigène-anticorps

Ninhydrine Réagit avec les acides aminé pour former un composé coloré

Bromure d'éthidium Le bromure d'éthidium (Bet) interagit par interactions hydrophobes avec les cycles des bases des acides nucléïques (phénomène de "stacking").   Le Bet s'intercale donc entre 2 bases contigües sur chaque brin. Sous l'action de photons UV, il ré-emet de la fluorescence qui permet de visualiser les acides nucléïques sur un gel d'agarose par exemple.

Fuchsine Base de Schiff, réagit avec les aldéhydes Des glucides pour donner coloration magenta Noir Soudan Colorant azoïque soluble dans Gras et insoluble dans eau

Exemple : HYDRAGEL 7, 15 & 30 LIPO + Lp(a) kit est destiné au dépistage de la Lipoprotéine (a) et à la séparation des différentes classes de lipoprotéines plasmatiques en vue de typer l'hyperlipémie L'électrophorèse en gel d'agarose prêt à l'emploi, suivie d'une coloration au noir Soudan, permet une identification facile des fractions LDL, VLDL, Lp(a) et HDL.

Méthodes de fractionnement V- Les chromatographies Définition Méthode de fractionnement et d‘analyse immédiate par entraînement au moyen d‘une phase mobile (liquide ou gaz) au travers d‘un phase stationnaire (solide ou liquide fixé) Basée sur la migration différentielle des solutés due à leur répartition: Entre la phase stationnaire: Rétention Et la phase mobile: Mobilité Suivant la phase mobile, on distingue: La chromatographie en phase gazeuse La chromatographie en phase liquide

Définition chromatographie 1906: expérience Tswett signe naissance chromatographie Chromatographie: ensemble de techniques pour la séparations de mixtures de substances basé sur la distributions entre deux phases: phase stationnaire solide liquide sur support inerte situé dans une colonne disposée sur un plan phase mobile gaz liquide Chromatographie sur papier Chromatographie sur couche mince

Principe de la séparation L’analyte se partage entre la phase stationnaire et la phase mobile selon un équilibre réglé par la constante K K = CS/CM= coefficient de distribution ou de partage CS = concentration analyte dans la phase stationnaire CM = concentration analyte dans la phase mobile

Chromatographie sur colonne: 1) colonne remplie, en verre ou acier éluant: phase mobile substances à séparer collection de petits volumes d’éluant Utilisation: séparation mélanges purification substances Chromatographie sur colonne: 1) colonne remplie, en verre ou acier colonne remplie d’une poudre: phase stationnaire coton ou laine de verre

Chromatographie sur colonne: 2) colonne capillaire

Schéma de principe d’un chromatographe Générateur de phase mobile injecteur colonne détecteur acquisition le résultat d’une analyse chromatographique est un chromatogramme

séparation des produits (grâce à la  affinité des analytes Principe de la séparation Mélange de produits séparation des produits (grâce à la  affinité des analytes par les phases stationnaire et mobile)

Chromatogramme tR = temps de rétention = intervalle de temps employé par un composé pour sortir de la colonne tM = temps mort = temps de rétention d’un composé pas retenu (standard interne) temps A tRA tRB B h W1/2 WB Intensité du signal chaque pic correspond à un produit pur si la séparation a été correctement réalisée, donc tRA ≠ tRB

Définitions V0 = volume mort = volume d’éluant dans la colonne (ou mieux entre l’injecteur et le détecteur) VR = volume de rétention = volume d’éluant nécessaire pour la sortie d’un composé de la colonne K = CS/CM= coefficient de distribution ou de partage k’ = facteur de capacité = nS/nM = CsVs / CMVM = K VS/VM rapport des quantités de soluté entre la phase stationnaire et la mobile α (alfa) = KB/KA = sélectivité = capacité d’un système chromatographique à séparer deux analytes (KB>KA) N = nombre de plats théoriques, efficacité d’une colonne (obtention pics fins) N = L/H = longueur colonne/ hauteur d’un plat théorique

Résolution ΔZ A B h wA Rs > 1.5 OK tRA tRB temps A tRA tRB B h W1/2 WB ΔZ wA Rs donne la mesure quantitative de la capacité d’une colonne à séparer deux analytes RS = 2 ΔZ (WA + WB)/2 (tRB-tRA) = WA + WB Rs < 1.5 Rs > 1.5 OK

Analyse quantitative en chromatographie Quand l’objectif est de quantifier un composant d’un mélange 2 conditions sont requises: 1) séparation des analytes dans la colonne 2) proportionnalité signal/quantité d’analyte (détecteur) temps tR Dosages basés sur: Hauteur pic (h) Aire pic (A) h A

Chromatographie en phase liquide Phase stationnaire Chromatographie d‘adsorption adsorbant solide Chromatographie de partage liquide fixé sur un support solide Chromatographie d‘échange d‘ions résine portant des groupements ionisés Chromatographie d‘exclusion solide poreux Chromatographie d‘affinité macromolécule porteuse d‘un affecteur qui présente une bioaffinité pour un soluté de l‘échantillon V-1 Les différents types de chromatographie liquide

V-2 La chromatographie d‘adsorption Principe Partage des solutés entre l‘adsorbant solide (fixe) et la phase mobile (liquide) Adsorption Due aux liaisons secondaires de surface entre l‘adsorbant et le soluté Fixation réversible des molécules dissoutes sur la phase stationnaire Adsorption (phénomène de surface): solides très divisés Les différentes chromatographies d‘adsorption Sur colonne Sur couche mince Sous pression (HPLC)

V High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Méthode de séparation de composés peu volatils ou thermodégradables La séparation se fait dans une colonne avec pour avantage une grande variété au niveau des phases stationnaires disponibles Elle permet: La microanalyse (du µg au mg) La séparation de mélanges complexes Une analyse qualitative et quantitative aisée Phase mobile: liquide (solvant pure ou mélange) Phase stationnaire: solide adsorbant Séparation des constituants d’un mélange: on définit un temps de rétention tR 46

Colonne HPLC Acier inoxydable Longueur 10 – 30 cm Diamètre intérieur 4 – 10 mm

Généralités sur la chromatographie en phase liquide CLHP = chromatographie liquide à haute performance HPLC = high performance liquid chromatography Phase mobile = liquide exemple HPLC Shimadzu

V-3 La chromatographie de partage Principe Partition différentielle de chacun des solutés entre deux liquides non miscibles. Un liquide est la phase mobile et l‘autre la phase stationnaire Coefficient de partage Rapport des concentrations de soluté dans les deux phases à l‘équilibre Plateau théorique (N) Hauteur de support nécessaire pour que la phase mobile, quittant un plateau, soit en équilibre avec le soluté fixé sur la phase stationnaire du plateau suivant.

V-3 La chromatographie de partage Différentes techniques Les supports: Chromatographie sur colonne: support imprégné d‘un éluant (gel de silice). Chromatographie sur papier: épaisseur et texture Les éluants (on joue sur la polarité des solvants ou mélanges de solvants Applications Analyse qualitative (dépôts non quantitatifs, identification par utilisation de témoins ou par mesure de Rf) Analyse quantitative (dépôts quantitatifs et dosage des solutés par planimétrie, densitométrie,…)

V-4 La chromatographie par échange d‘ions Échangeur d‘ions Macromolécule insoluble portant des groupements ionisables pouvant échanger, de façon réversible, des ions avec d‘autres ions provenant d‘une solution Différents types de supports Les résines de copolymérisation Les Séphadex ou polyosides (dextranes ou cellulose) Caractérisation des résines par: Le taux de pontage La dimension des pores

Sephadex Propriétés Taille particules à sec Gamme de masses molaires fractionnées

V-4 La chromatographie par échange d‘ions Les groupements fonctionnels des résines et Sephadex Groupements fixés de façon covalente Résines ou Séphadex sont divisées en: Résines ou Sephadex cationiques Fortes: groupements sulfoniques Faibles: groupements carboxyliques Très faibles: groupements phénoliques Résines ou Sephadex anioniques Fortes: groupements de type amine quaternaire et tertiaire Faibles: groupements de type amine secondaire et primaire

V-5 La chromatographie d‘exclusion Principe Séparation en fonction de la taille et de la forme par utilisation de granules de gel poreux Les gels •Petites billes sphériques (Ø de 40 à 300 μm) •Porosité très homogène (Ø des pores de 4 à 50 nm) définie par le procédé de fabrication - Polymères réticulés de nature organique ou minérale - Plus le gel est réticulé, plus les pores seront petits Les gels hydratés (Sephadex, polyacrylamide) Hydrolysés en milieu acide fort Sensibles à l‘hydrolyse enzymatique Les gels permanents Organiques (copolymères, gel de polystyrène – divinylbenzène (Styragel) ) Minéraux (silice)

Principe de la séparation 1/ Mélange de molécules de tailles différentes 2 / Petites et moyennes molécules peuvent pénétrer dans les pores; les grosses en sont exclues 3 / La phase mobile entraîne l’ensemble des molécules 4 / Les molécules incluses dans le gel ont une vitesse de migration plus faible que les grosses

- Les petites et les grosses molécules sont donc éluées différemment Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement puisque incluses dans le gel. Les grosses molécules (diamètre supérieur à celui des pores) exclues sont donc éluées les premières. Phase stationnaire dans la colonne

V-5 La chromatographie d‘exclusion Caractéristiques des gels Diamètre des granules Diamètre des pores Surface spécifique (en m²/g) Applications Déminéralisation des protéines Séparations - protéines, peptides, triglycérides, osides,… dans eluantes polaires - molécules peu polaires ou apolaires (lipides, polymères synthétiques …) dans éluants apolaires Détermination des masses molaires

V-6 La chromatographie d‘affinité Principe Les protéines forment avec certaines macromolécules ou molécules des complexes spécifiques de manière réversible Phase stationnaire: ligand (effecteur) lié de manière covalente à un support inerte (présence d‘un “spacer“) Phase mobile contient le partenaire d‘affinité

V-6 La chromatographie d‘affinité Les supports Insolubles dans l‘eau Poreux Stables chimiquement et mécaniquement Porteurs de groupements fonctionnels Les effecteurs En enzymologie: substrats, analogues de substrats, inhibiteurs réversibles et coenzymes En immunologie: antigènes, anticorps, haptènes,… Pour l‘étude des protéines réceptrices: hormones Applications Extraction Purification Étude de protéines membranaires Fractionnement des divers acides nucléique

Chromatographie en phase gazeuse= gaz est phase mobile (CPG) Chromatographie gaz - solide Phase stationnaire: adsorbant solide Chromatographie gaz - liquide Phase stationnaire: liquide fixé sur un support solide inerte

V-7 La chromatographie en phase gazeuse (CPG) Méthode de séparation de composés susceptibles d’être vaporisés par chauffage (sans décomposition) La séparation se fait dans une colonne soit par partage soit par adsorption Elle permet: La microanalyse (du pg au mg) La séparation de mélanges complexes (stéroïdes, acides gras, …) Une analyse qualitative et quantitative aisée Phase mobile: gaz vecteur Phase stationnaire: solide adsorbant Séparation des constituants d’un mélange: on définit un temps de rétention tR

La séparation des substances a lieu grâce à la différente affinité d’un soluté pour la phase stationnaire (adhésion / liaison chimique / adsorption physique)

V-7 La chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Caractéristiques système Phase mobile = gaz vecteur ou porteur: hélium, azote, H2, argon, CO2 Colonne: 1) remplie 2) tubulaire ouverte=capillaire (longueur 10-100 m) Longueur: 30 cm/2-3 m Diamètre interne 2-4 mm acier inoxydable, verre, silice fondue, téflon

V-7 Chromatogramme (CPG) Injecteur Colonne Détecteur

Exemple application industrie alimentaire: chromatogramme résultant de l’analyse des arômes contenus dans une barre chocolatée Colonne CPG: PTE-5; 30m x 0,25mm ID;  0,25µm film Four: 60°C (1 min) jusqu’à 230°C à 10°C/min phase mobile: helium, 35cm/sec Det.: FID, 250°C Inj.: splitless (split fermé 3 min), 250°C

Application gaz chromatographie dans les laboratoires de médicine-légale: Analyse fluides corporels pour détecter présence substances illégales Analyse fibres et sang de la « crime scene » Détection résidus explosives Doping Conclusion = gaz chromatographe est un outil précieux car il permets de détecter de traces = haute sensibilité, une petite quantité de substance est nécessaire pour avoir un signal

chromatographie en phase gazeuse Schéma Chromatographie chromatographie en phase gazeuse CPG ou CG (phase mobile = gaz) chromatographie en phase liquide (phase mobile = liquide) chromatographie de répartition (phase stationnaire liquide) (phase stationnaire solide) d’exchange ionique d’absorption chromatographie sur gel Chromatographie gaz-solide phase stationnaire solide (CGS) Chromatographie gaz liquide phase stationnaire liquide (CGL)