L’ADN chez les eucaryotes Chapitre 4 Biologie moléculaire titre 3ème partie L’ADN chez les eucaryotes et le génie génétique

plan 1. Contrôle génétique chez la bactérie. 2. Les transferts d’ADN. 2.1. La conjugaison. 2.2. La transfection. 2.3. La transformation. plan 3. Génie génétique. 3.1. Les sondes moléculaires. 3.2. PCR. 3.3. Les plasmides de clonage. 3.3.1. Les plasmides vecteurs. 3.3.2. Les enzymes de restriction. 3.3.3. Transformation. 3.3.4. Sélection des bactéries.

1 PLAN 1. Contrôle génétique chez la bactérie: l’opéron p z y a polymérase promoteur p z y a ARN polycistronique b-galactosidase perméase La polymérase reconnaît le promoteur et transcrit les trois gènes codants. transacétylase PLAN

1 PLAN 1. Contrôle génétique chez la bactérie: l’opéron répression 1 répresseur opérateur p z y a répresseur site de fixation pour la séquence opérateur K = 10-13 mol.L-1 Le répresseur est un tétramère (4 x 37 kDal) très forte affinité 4 sites de fixation pour l’inducteur K = 10-6 mol.L-1 PLAN

1 PLAN 1. Contrôle génétique chez la bactérie: l’opéron induction 1 promoteur répresseur opérateur lactose Le lactose est un inducteur de la synthèse des enzymes. L’IPTG (isopropylthiogalactoside) est un inducteur gratuit (non métabolisable) PLAN

2,1 PLAN 2. Les transferts d’ADN. Définition: transfert de matériel génétique d’une bactérie vers une autre par un pont cytoplasmique grâce à la présence d’un facteur F. 2.1. La conjugaison. Le facteur F est un brin d’ADN circulaire capable de s’intégrer dans le chromosome bactérien. C’est un épisome. bactérie F+ 2,1 Il code pour les pili. Ce sont des appendices situés à la surface de la paroi de nombreuses bactéries à Gram négatif (et exceptionnellement des bactéries à Gram positif), plus courts et plus fins que des flagelles. bactérie F- Ils sont responsables des transferts moléculaires. fimbrae Ils codent également pour certains gènes de résistance. Les fimbrae sont des appendices plus courts qui interviennent dans la fixation de la bactéries sur des récepteurs. pili PLAN

2,1 PLAN 2. Les transferts d’ADN. 2.1. La conjugaison. Il existe deux types de transfert: Le transfert du facteur F. 2,1 Le transfert du chromosome bactérien. Dans ce cas, le facteur F s’intègre au chromosome (souche Hfr) et le « pousse » vers la cellule réceptrice. Les gènes peuvent s’échanger par recombinaison homologue. PLAN

2,2 PLAN 2. Les transferts d’ADN. Définition: transfert de matériel génétique d’une bactérie vers une autre par l’intermédiaire d’un virus. 2.2. La transduction. La transduction est le transfert d'ADN bactérien par l'intermédiaire de bactériophages (ou phages). Les phages virulents se multiplient dans la bactérie (ou mieux sont répliqués par la bactérie) et la lysent. 2,2 Les phages tempérés s'intègrent dans le chromosome bactérien sans induire la réplication et sont répliqués en même temps que lui. Le bactériophage est alors appelé prophage et la bactérie qui en est porteuse, une bactérie lysogène. Dans une population de bactéries lysogènes, un prophage se libère de temps à autre du chromosome bactérien, devient virulent, se multiplie, provoque la lyse de la bactérie et peut infecter de nouvelles bactéries. Si, au cours de sa libération, le prophage emporte avec lui plusieurs gènes bactériens, il peut y avoir transfert par le bactériophage de gènes bactériens d'une bactérie (lysogène) à une autre (lysogène). C'est la transduction. PLAN

2,3 PLAN 2. Les transferts d’ADN. 2.3. La transformation. La conjugaison consiste en la pénétration d'ADN bactérien sans intermédiaire biologique. La transformation naturelle ou physiologique exige l'état de compétence qui n'apparaît qu'à certains stades de la division cellulaire et seulement chez une fraction de la population bactérienne. La transformation artificielle est précédée du traitement chimique ou enzymatique de la paroi bactérienne avant sa mise en contact avec l'ADN. 2,3 In vitro, l’état de compétence est provoqué par l’utilisation de solution riche en ions calcium (CaCl2) PLAN

3. Génie génétique. Définition: Fragment d’ADN, marqué par des moyens chimiques, qui possède une séquence complémentaire d’un gène d’intérêt. 3.1. Les sondes moléculaires. 3,1 Le fragment d’ADN intègre du 32P radioactif. Utilisation « in situ »: permet d’identifier les cellules qui ont intégré l’ADN d’intérêt. Transfert sur membrane en nitrocellulose Lyse des cellules incubation avec une sonde radio Culture bactérienne autoradiographie colonies porteuses du gène. PLAN

3. Génie génétique. Définition: Fragment d’ADN, marqué par des moyens chimiques, qui possède une séquence complémentaire d’un gène d’intérêt. 3.1. Les sondes moléculaires. 3,1 Le fragment d’ADN intègre du 32P radioactif. Utilisation comme révélateur pour une électrophorèse. Il permet d’identifier les bandes qui contiennent le gène d’intérêt. transfert sur membrane de nitrocellulose incubation avec la sonde radioactive bandes contenant le gène d’intérêt gel d’électrophorèse PLAN

(polymérase thermorésistante) 3. Génie génétique. PCR: « Polymerase Chain Reaction » Procédé permettant l’amplification in vitro de fragments d’ADN par un procédé enzymatique. 3.2. La PCR. 3,2 Incubation: ADN Nucléotides Amorces Taq polymérase (polymérase thermorésistante) T = 95°C -----> dénaturation ADN T = 60°C -----> hybridation ADN / Amorces T = 72°C -----> élongation et copie ADN ...et le cycle recommence ! PLAN

3,3 PLAN 3. Génie génétique. 3.3. Les plasmides de clonage. plasmide pBr322 gène d’intérêt site BamH1 Ramp Rtet + BamH1 amplification du plasmide multiplication bactérienne + ligase transfert dans la bactérie PLAN

3,3,1 PLAN 3.3. Les plasmides de clonage. 3.3.1. Les plasmides vecteurs. On a vu que les plasmides sont des molécules d’ADN circulaires simple brin. Ils ont une réplication autonome. Elle débute au niveau du gène ori. Ils codent pour certaines fonctions, en particulier la résistance à certains antibiotiques. Ils possèdent des séquences cibles pour plusieurs enzymes de restriction, positionnées dans des zones stratégiques. De nombreux plasmides de ce type sont fabriqués in vitro par assemblages de différents gènes utiles au clonage, les plasmides vecteurs. PLAN

3,3,2 - - - GAATT C - - - - - - C TTAAG - - - PLAN 3.3. Les plasmides de clonage. 3,3,2 3.3.2. Les enzymes de restriction. Les enzymes de restriction sont des endonucléases qui reconnaissent et coupent des séquences de nucléotides très spécifiques appelées sites de restriction. Ces sites sont pour la plupart palindromiques, c'est-à-dire qu’ils sont composés de séquences nucléotidiques identiques sur les deux brins mais en orientations antiparallèles. Ésope reste ici et se repose L'âme sûre ruse mal. EcoRI - - - GAATT - - - C C - - - TTAAG - - - Les extrémités sont jointives, on parle de « bouts collants » Il existe également des enzymes qui coupent des extrémités franches. PLAN

3,3,2 - - - GAATT - - - C C - - - - - - - - - - - GAATT 3.3. Les plasmides de clonage. 3,3,2 3.3.2. Les enzymes de restriction. ADN (ou plasmide) recombinant: ADN formé de séquences d’origines différentes. On peut facilement insérer un fragment d’ADN s’il a été coupé par la même enzyme de restriction - - - GAATT - - - C C - - - - - - - - - - - GAATT TTAAG - - - - - - - - - - -C C - - - TTAAG - - - Une ligase est nécessaire pour former les liaison diester entre les nucléotides des extrémités. Remarque: Rien n’empêche le plasmide de se refermer sur lui même sans insérer l’ADN. En pratique on joue sur le rapport de concentration plasmide / ADN On obtient un ADN recombinant. PLAN

3,3,3 PLAN 3.3. Les plasmides de clonage. 3.3.3. Transformation. Les bactéries sont capables, dans certaines conditions, de prélever de l’ADN dans leur environnement. Incubation du plasmide avec les bactéries dans un milieu riche en Ca2+ . L’ADN se « colle » à la paroi bactérienne. Choc thermique Les bactéries absorbent l’ADN. Le pourcentage de réussite est généralement très bas. PLAN

3,3,4 PLAN 3.3. Les plasmides de clonage. 3.3.4. Sélection des bactéries transformées. 3,3,4 Ramp bactéries recombinantes Il existe trois types de bactéries: La présence du plasmide apporte à la bactérie la résistance à l’ampicilline. bactéries transformées Ramp Les bactéries qui possèdent le plasmide se développent en présence d’ampicilline. bactéries non transformées colonies de bactéries possédant le plasmide. Ensemencement sur milieu + amp PLAN

3,3,5 PLAN 3.3. Les plasmides de clonage. 3.3.5. Sélection des bactéries recombinantes. 3,3,5 Ramp bactéries recombinantes Il reste deux types de bactéries: le gène Rtetest tronqué La présence du gène retire au plasmide la résistance à la tétracycline. Les bactéries recombinantes ne se développent pas en présence de tétracycline. bactéries transformées Ramp Rtet On utilise la technique du tampon de velours bactéries transformées bactéries recombinantes Ensemencement sur milieu + tet réplique sur milieu sans tétracycline PLAN