La Validation de Méthode en Cytogénétique Partie 1 : Théorie XXIIIème colloque ATC 20 septembre 2013 Suzanne CHEVALLIER, Technicienne

La validation/vérification de méthode une exigence normative et réglementaire Ordonnance n° 2010-49 du 13 janvier 2010 accréditation obligatoire de tous les laboratoires avant fin octobre 2020 preuve d’entrée dans la démarche avant fin octobre 2013. référentiel d’accréditation opposable = NF EN ISO 15189 Chapitre 5 de la Norme NF EN ISO 15189, paragraphe 5.5.2 et 5.5.3 COFRAC : Guide technique d’accréditation de vérification /validation des méthodes en Biologie Médicale (SH GTA 04) + formulaire SH FORM 44. ACLF : Guide pour un dossier de validation en cytogénétique constitutionnelle et en FISH. (version 1, 19/03/2013) Comme vous le savait en 2009, par la loi HPST Hôpital Patient Santé Territoire une réforme générale du système de santé français a été engage c est dans le cadre de cette loi et par voie d’ordonnance que l’état a réforme les condition de création, d organisation et de fonctionnement de LBM. Cette ordonnance du 13 janvier 2010 valorise deux axes celui de la médicalisation de la biologie médicale et celui de l’accréditation obligatoire de tous les LBM avant octobre 2020 le référentiel d’accréditation opposable choisi par le législateur la norme 15189. Dans le chapitre 5 qui traite des exigences techniques la norme nous dit …..comme vous l’entendaient ce language normatif toujours assez vague c’est quelque part un peu compréhensible car une norme résulte d’un consensus internationale ou tous les pays doivent ce mettre d’accord sur le contenu. A charge ensuite à chaque pays d’expliciter et d’apapter la norme à leur propre contexte.En France, c’est le rôle du COFRAC Comite FRançais d’AC créditation (qui délivre l’accréditation ) .Pour les exigences concernant la validation de méthode le cofrac a édité un guide technique SH GTA 04 et un formulaire le SH FORM 44. Enfin les société savante de chaque discipline diffusent des guide explicitant les exigence du COFRAC dans la discipline concerné . Pour cette présentation nous avons repris les grande ligne du document édité par par l’ACLF l’Association des Cytogénéticien de langue Française. Le laboratoire doit utiliser uniquement des procédures validées pour s’assurer qu’elles conviennent à l’utilisation prévue. Les validations doivent être aussi approfondies que nécessaires pour répondre aux besoins […]. Le laboratoire doit enregistrer les résultats obtenus et la procédure utilisée pour la validation. les procédures doivent être documentées et être disponibles au poste de travail du personnel concerné. Extrait du chapitre 5 traitant des exigences techniques, paragraphe 5.5.2 et 5.5.3 2 2

Formulaire téléchargeable sur le site www.cofrac.fr Depuis l’arrêté du 17 octobre 2012, ce document doit être obligatoirement transmis au COFRAC. Complété après constitution et rédaction de votre dossier de validation/vérification de méthode (qui lui doit être disponible au poste de travail). Résumé standardisé du ce dossier, ce qui facilite la compréhension de la démarche de validation/vérification des méthodes par l’évaluateur technique du COFRAC. Voici l’entête du SH FORM 44 VERIFICATION de méthode (en portée A) : examen est réalisé avec une méthode normalisée (Dispositif Médical de Diagnostic In Vitro marqué CE appelée DM-DIV ). On se limite à vérifier que les performances annoncées sont bien reproduites dans notre laboratoire.   Ex : Recherche d’aneuploïdie des chromosomes 13,18 et 21 au moyen d’un kit de sondes marqué DM-DIV et quand on respecte la notice du fournisseur. VALIDATION de méthode (en portée B)  : examen est réalisé par une méthode développée (ou adaptée) par le LBM. Ex : Recherche d’aneuploïdie des chromosomes 13,18 et 21 par des sondes « maison». 3

Paramètres à étudier lors d’une vérification / validation de méthode Dans son guide technique le CORAC définit très précisément Les paramètres a étudier pour constituer le dossier de validation… Extrait du guide technique, SH GTA 04-rév.00-Avril 2011 Lobbying auprès de nos fournisseurs élargir l’offre de DM DIV dans notre discipline. 4

Énoncer l’examen, par exemple : caryotype constitutionnel sur lymphocytes (faire un dossier de validation par examen et sur chaque matrice) 1) Matrice je veus dire par la nature du prélèvement un dossier les lymphocytes un autre pour les amniocytes. La procédure de validation consiste à décrire le processus de validation elle est généralement concu comme un logigramme reprenant toutes les étapes du processus en y associant les personnels responsables de chaque étape et les documents associés (références des formulaires d’enregistrements, fiches techniques, etc.). La procédure de gestion de la portée flexible, détermine les conditions de maîtrise du processus en cas de changement (de locus, de méthode, d’appareillage, de logiciel, etc). C’est une sorte de checklist résumant toutes les actions à réaliser en cas de changement; Mais nous pouvons être rassuré ces procédures ne nous imcobe pas elle directement nous devos les connaître elle sont en générale rédigé par le RAC du pole de biologie . Je vous rassure ces procedure ne nous incombe pas directement on doit juste les appliquer et elles sont en générale rédigé par la cellules qualité. Donner succinctement le principe  : Ex1 :Culture lymphocytaire / Préparations cytogénétiques / Dénaturation et Coloration des chromosomes / Microscopie Optique / Analyse d’images Ex 2 :FISH suivie d’une analyse visuelle des signaux et d’une acquisition sur système d’analyse d’images Le mesurande est ce qu’on analyse. Pour le caryotype, c’est « le chromosome », « le locus » étudié. Décrire en un ou deux mots la méthode : Ex :Comptage/analyse morphologique Si réactifs marqués DM-DIV CE. AFSSAPS ne souhaite pas référencer l’EEQ / ACLF veux faire l’accréditer l’EEQ. Citez la référence de la procédure générale de validation des méthodes de votre laboratoire que vous avez appliquée. L’évaluateur technique du Cofrac vous demandera ce document. Nom du ou des opérateurs habilités ayant réalisés les tests de validation de la méthode (il faut au moins un biologiste) Citez la référence de la procédure générale de gestion de la portée flexible de votre laboratoire que vous appliquerez. L’évaluateur technique du Cofrac vous demandera ce document. Nom du biologiste médical ou cytogénéticien ayant autorisé la mise en routine de l’examen 5

Aurore va vous donner des exemples pratiques C’ est l‘étape la plus importante dans la validation des méthodes qualitatives. Il s’agit de dresser l’inventaire des modes de défaillances potentielles et établir un plan d’action. (exigences relatives au management : point 4.11 de la norme NF EN ISO 15189). Dans ce tableau il est demandé de mentionner les risques les plus importants, avec pour chaque risque, l’action mise en place en face pour qu’il ne se produise pas. 6

Diagramme des cinq M Demande d’examen Résultat rendu Pour avoir analyse la plus exhaustive des éléments impactant la réalisation de l’examen nous avons appris au DU Qualité la méthodologie des 5M. Le trait horizontal représente le processus analytique. A gauche, se situe l’élément d’entrée dans le processus (la demande d’examen) et à droite la sortie du processus (le résultat rendu) de part et d’autre de cette droite se situent des flèches représentant les éléments de mise en œuvre du processus que nous pouvons répartir en 5 catégories (Matière, Moyen, Milieu, Main d’œuvre, Méthode). Cette disposition permet d’avoir une vue très exhaustive des éléments impactant le processus analytique. Il est recommandé de réaliser ce diagramme en présence de tous les acteurs concernés, puis de définir les points critiques et de formaliser leur maîtrise dans le dossier de validation. On pu qu a lister les paramrtre de la methode Demande d’examen Résultat rendu   7

Analyse des contamination inter-échantillons ou inter-réactifs Spécificité diagnostique ( = l’étude des faux positifs par analyse de témoins sains ) aptitude d'une procédure d'analyse de DIV à reconnaître l'absence d'un marqueur cible associé à une maladie particulière ou à un état particulier GBPC p 18, FISH interphasique spécifique à 95 % Validation en Portée B : On vient de fabriquer une sonde sur un loccus 21 test cette sonde sur un pool de 5 patients masculins normux.(% inf à 5% de faux positif) s Sensibilité diagnostique = (=l’étude des faux négatifs par analyse de témoins portant l’anomalie). La probabilité qu'un dispositif donne un résultat positif en présence du marqueur cible. CNEPGM , 10% des cas de trisomie du a des réarrangements ou à des mosaïque faible. Validation en Portée B : Test la sonde sur patients atteind d’une trisomie libre homogène. Ex Biblio : GBPC p 18, FISH spécifique à 95 % (5 % d’artéfact sont tolérable) Ex étude sur site : Comptage de signaux d’un locus 21 sur un pool de 5 patients masculins normaux . Commance a ce mettre en route au GFCH groupe, (J1 : divisible par trois (un diag) encemmencer le meme jour dans chaque labo.) Analyse des contamination inter-échantillons ou inter-réactifs important pour les labos ayant automatisés des étapes techniques (automate d’étalement …). Comparer notre méthode sur un nombre significatif d’échantillons (40 SFBC), par exemple : Avec un autre laboratoire utilisant la même méthode (CIL) a débuté GFCH ). Avec une autre méthode mise en œuvre dans votre laboratoire donnant le même résultat( FISH/CGH/Caryo). 8

Ex: changement d’opérateur. La robustesse est la capacité à ne pas être affectée par de faibles variations des paramètres. Ex: changement d’opérateur. La robustesse est la capacité à ne pas être affectée par de faibles variations des paramètres. Ex caryo : hygrométrie lors de l’étalement, température de dénaturation, changement d’opérateur. Ex FISH : la température et la durée de dénatura ration et d’hybridation, température et stringence des lavages, nature et concentration de la sonde. Tester la roustesse d’un technicien. EEQ fait par chaque opérateur. Il faut tester ici la stabilité des réactifs sur leur durée d’utilisation 9

Titre Sous-titre Xxxx Texte xxxxX 10 26 octobre 2012 NOM PRÉNOM