Utilisation de la CGH en cytogénétique hémato-oncologie: Le cas de Mr Ras… Génétique –hématologie oncologique CHU St Eloi Montpellier

Histoire de la maladie 1/02/16 17/02/16 02/16 Homme 20 ans Pas d’ATCD particulier Asthénie 17/02/16 Douleur gingivale bilatérale Bilan dentaire normal 02/16 Antalgique (paracétamol codéiné) + Anti-inflammatoire (AINS) Hyperleucocytose (69,7 G/L) dont 97% blastes Légère anémie (12,5 g/dL) Thrombopénie (116 G/L) Urgences CH Mendes ……Hématologie Montpellier … Suspicion LAM (1/03/16)

LAM : généralités Hémopathies malignes caractérisées par l’expansion clonale de cellules myéloïdes immatures dans la moelle, le sang ou autres tissus Incidence annuelle: 4 pour 100 000 adultes Taux de mortalité : 4 à 6/100 000 par an Fréquence augmente après 40 ans Age moyen : 65 ans Peu fréquente chez les enfants Atteinte des deux sexes de manière sensiblement égale

Bilan clinique à l’arrivée

Bilan biologique sanguin à l’arrivée (1) En faveur d’une leucémie aigue myéloblastique

Le diagnostic de LAM nécessite Une étude morphologique : cytologie et cytochimie Un immunophénotypage Analyse cytogénétique : caryotype + FISH Biologie moléculaire: recherche de remaniements géniques Ponction de moelle en sternal

Myélogramme Etablir le diagnostic Frottis médullaire MGG (x10) Moelle : 92% blastes

Myélogramme (2) Frottis médullaire MGG (x100) GE GE

Leucémie aigue myéloblastique sans maturation granuleuse Cytochimie Moelle MGG (X100) Noir soudan : 25% (MO) Bleu de toluidine : 4% (MO) Leucémie aigue myéloblastique sans maturation granuleuse ou LAM1 (FAB)

Immunophénotypage Outil majeur Diagnostic des leucémies aigues Complète l’analyse morphologique Technologie simple et rapide

Immunophénotypage (2) Analyse les cellules en suspension devant un faisceau lumineux Mesure les caractéristiques physiques des cellules : T/S/F Etude bi-paramétrique taille/structure Suspension cellulaire cellules sanguines Granuleux Granularité (SSC) Monocytes Lymphocytes (B, T, NK) Débris cellulaires Erythrocytes Taille (FSC)

Immunophénotypage (3) Isolement et Identification des cellules blastiques: Degré de différentiation cellulaire BLASTES : SSClow/CD45low Granularité (SSC) 97% de cellules dans la région blastique (Sang veineux) CD45 faible CD34+ HLA-DR+ Expression partielle et hétérogène Leucémie aigue

Immunophénotypage (4) Détermination de la lignée Lignée B: CD19- Lignée T : CD3- Lignée myéloïde MPO 23% (cytochimie +) Marqueurs myéloïdes «  généraux » CD13- CD117- CD33 61% Marqueurs granulocytaires et monocytaires CD15- CD65- CD14- CD64- CD11c- Marqueurs érythrocythaires et plaquettaires GlycoA- CD41- Marqueurs aberrants Lignée B : CD79a- CD10- CD20- CD22- Lignée T : CD3- CD1a- CD2- CD4- CD5- CD7 98% CD8- CD56- CD57- Marqueurs spécifiques des LpdC (Leucémies dérivées de cellules dendritiques plasmocytoïdes) CD4+/CD56+ négatif

Bilan Leucémie aigue myéloïde Absence d’expression de marqueurs caractéristiques des autres lignées : Lignée B Lignée T (exception : CD7) 30% LAM témoin d’immaturité Conclusion : 97% de blastes sanguins CD34+, HLA-DR+, avec expression des marqueurs myéloïdes MPO (expression faible), CD33 et expression de CD7. Profil phénotypique identique dans la moelle osseuse. Classification OMS : LAM sans maturation CD7: suivi maladie résiduelle

Etude cytogénétique (1 ) Moëlle Numération : 227 M Culture synchronisées : 24h et 48H Bandes GHG Frottis médullaires (FISH)

Inclusion dans le protocole BIG-1 BIG-1 : essai Backbone Inter-Group-1 Nombre de patients : 3000 Essai de phase 3 visant à améliorer la survie globale des LAM de l’adulte de 18 à 60 ans en comparant CONSOLIDATION Cytarabine (FD) Vs Cytarabine (DI) ENTRETIEN Rémission complète Mycophénolate Mofétil Prophylaxie standard INDUCTION Idarubucine (FD) Daunorobicine GREFFE

Etude cytogénétique (2) Etape 1: diagnostic d’exclusion (48H) Réarrangements CBF de bon pronostic FISH sur frottis LSI CBFB Dual Color Break Apart Rearrangement probe (Vysis) LSI RUNX1 Spectrum Green Probe (Vysis) LSI RUNX1T1 Spectrum Orange Probe (Vysis) Pas de t(8;21) RUNX1T1/RUNX1 Pas de réarrangement CBFB (inv 16)

EVI 1 t(3;3), inv(3) Break probe (Kreatch) Etude cytogénétique Etape 2: Recherche de réarrangement MLL et EVI FISH sur frottis pronostic péjoratif dans LAM LSI MLL Dual Color Break Appat Rearrangement Probe (Vysis) EVI 1 t(3;3), inv(3) Break probe (Kreatch) Pas de réarrangement EVI 1 Pas de réarrangement MLL

Etape n°3 : réalisation du caryotype (bandes GHG) 46,XY,der (7) t (7;?)(p15;?),t(10;11)(p13;q21)[11]

46,XY,der (7) t (7;?)(p15;?),t(10;11)(p13;q21),del (20)(q11,2) q[6]

Confirmation par FISH Présence d’une délétion 20q 20q Deletion Breakapart (Cytocell) Présence d’une délétion 20q dans 17% des cellules

Biologie moléculaire Triple négatif Mutation du gène ECBPA (19q13.1) 10% LAM de l’adulte Pronostic favorable Mutation du gène NPM1 (5q35) 30% des LAM de l’adulte CD34 faible Mutation en tandem du gène FLT3 : FLT3-ITD (13q12) 20 à 30% LAM de l’adultes Pronostic péjoratif Triple négatif

sans marqueurs pour le suivi Adulte jeune LAM1 Hypercytaire CMF Confirmation T(10;11) Add7p?? +/- de20q sans marqueurs pour le suivi t(8;21) neg; Inv(16) neg MLL neg; EVI1 neg CEBPA - /NPM1 - Triple négatif FLT3-ITD - Suivi ? Diagnostic

Analyse de la moelle par CGH array Extraction ADN et digestion ADN tumoral (CY5) ADN témoin (CY3) Dépôts Mélange équimolaire Lavage + scan Mesure de la fluorescence + Analyse d’images Défaut d’ADN tumoral (Délétion) Excès d’ADN Tumoral (Amplification) Sondes Hybridation Equilibre

Analyse de la moelle par CGH array Le logiciel va calculer au niv de chaque sonde le ration ADN patient / ADN témoin Les résultats seront donnés sous forme graphique On analyse ainsi le génome entier on peut alors zoomer sur un chromosome particulier et obtenir le diagramme suivant : Puce utilisée: AGILENT Cancer CGH+SNP 4*180K Logiciel: cytogenomics

Chromosome 5 : 6 Microdélétions 5q Deletion (Cytocell) Délétion 5q 95% par microréarrangements Chromothripsis Del5q 5

Vérification si t(5;7) 7 Add (7)p 5 WCP : Pas de t(5;7) CGH : Add 7p ?

Chr 10 Chr 11

Résultat en faveur d’une t(10;11) Points de cassure dans les gènes MLLT10 (10p12) et PICALM (11q14) Translocation rare observée dans les LAL-T, LAM à marqueurs T..

Conclusion Conclusion LAM1 hypercytaire CD7 marqueur aberrant (lignée T) Caryotype complexe avec plus de 3 anomalies : 46,XY,der (7) t (7;?)(p15;?),t(10;11)(p13;q21)[11] 46,XY,der (7) t (7;?)(p15;?),t(10;11)(p13;q21),del (20)(q11,2) q[6] Chromothripsis (instabilité génomique +++) CGH: délétion 5q confirmation del20q Anomalie du 7 en cours d’exploration

Suivi possible en FISH frottis grâce à la sonde délétion 5q Conclusion (2) Idarabine Aracytidine TT confort INDUCTION Echec induction Rattrapage PRE-GREFFE J27 J100 GREFFE J1 J15 Sang 76% Sang 17% Mo 75% Del5q 78% J-2 DG J56 Pré-greffe Del 5q 45% Del 5q neg Suivi possible en FISH frottis grâce à la sonde délétion 5q J-1 : congélation de sperme J27: 2 CGR + 8 CPA

Remerciements CACHEUX Valère, GAZAGNE Isabelle, MACE Alexandra, PLATERO Dolorès LODE Laurence, ANGLES Mathieu, COURNUT Elisabeth, GUITTARD Caroline HICHERI Yostr, BRET Caroline, RUSSELLO Jennifer Hématologie, Génétique, Hématologie oncologique CHU St Eloi, Montpellier