Etat des travaux du projet BOARD De la génomique aux outils de diagnostic rapides : Applications industrielles Etat des travaux du projet BOARD Bacilles thermorésistants: des Outils d’Analyses au Recensement des Dangers

ADRIA, centre de transfert technologique Modélisation Formulation, durée de vie, process Microbiologie prévisionnelle  Qualité & sécurité de l’aliment au long de sa durée de vie Outils de diagnostic Détection, identification, traçabilité Microbiologie, moléculaire  Hygiène de production, maîtrise des flores d’intérêt

ADRIA, centre de transfert technologqiue Modélisation Formulation, durée de vie, process Microbiologie prévisionnelle Outils de diagnostic Détection, identification, traçabilité Microbiologie, moléculaire Réponse à des attentes : développement de produit, i.e. expertises, outils, transfert

(Re) émergence de bactéries …Bactéries sporulées Travaux en cours Perspectives & discussion  …Un bref état des lieux!

Productions primaires C. perfringens dans les élevages colonisation du tractus intestinal de volaille, porc contamination des environnements primaires augmentation de l’antibiorésistance des isolats2 augmentation de l’incidence d’entérite nécrotique chez les volailles suite à l’arrêt des antibiotiques comme facteurs de croissance3 les phénomènes de colonisation du tractus intestinal et de synthèse de toxines restent encore mal connus Contamination des viandes…plats cuisinés et restauration collective3! 1 Craven SE et al. 2001, Avian dis 45:887-896 2 Tansuphasiri et al. 2005, Southeast Asia J Trop Med Public Health 36:954-961 3 Van Immerseel F et al. 2004, Avian pathol 33:537-549

Productions secondaires Bacillus Hautement Thermorésistant dans le lait UHT (HRS) Brevibacillus, Geobacillus stearothermophilus, B. sporothermodurans 1,2 Lait UHT Homologie des empreintes génétiques Lait cru Hétérogénéité des empreintes génétiques 2 Olivier Guillaume-Gentil et al. 2004, Appl. Env. Microbiol 68:4216-4224 1 Scheldeman P et al. 2006, J Appl Microbiol 101:542-555

Productions secondaires Bactéries HRS dans les produits appertisés Moorella … …Brevibacillus, Geobacillus stearothermophilus, B. sporothermodurans, Paenibacillus Bactéries HRS et acidophiles dans les pectines de fruit - Alicyclobacillus

Productions secondaires Bacillus psychrotrophes dans les produits pasteurisés, conservés au froid groupe B. cereus émétique : B. weihenstephanensis 1 + 45 % entre 1999 et 2005 des produits réfrigérés prêts à l’emploi  - à noter : transfert du plasmide de B. anthracis vers B. cereus 2 1Thorsen L et al. 2006, Appl Environ Microbiol 72:5118-5121 2 Hoffmaster AR et al, 2004, Proc Natl Acad Sci U S A. 101:8449-54.

Adaptation ou sélection par le process ? Altérations! Bactéries sporulées, sélectionnées par les process ou adaptées aux process… ovoproduits poudre de lait produits pasteurisés conservés au froid produits UHT produits appertisés …etc Adaptation ou sélection par le process ? Etude de prévalence et analyse des dangers

Prévalence et analyse des dangers Quand la microbiologie fait défaut… dénombrements des spores après traitement thermique dénombrement de B. cereus dénombrement de C. perfringens Alicyclobacillus, Anoxybacillus, Bacillus, Brevibacillus, Clostridium, Geobacillus, Morella, Paenibacillus… Biodiversité de genres, d’espèces et de caractéristiques physiologiques, et donc de génomes!

(Re) émergence de bactéries …Bactéries sporulées  BOARD Perspectives & Discussion  …Un bref état des lieux!

BOARD Bacilles thermorésistants: des Outils d’Analyses au Recensement des Dangers Filières impliquées

Partenaires Partenaires industriels BBA (Bretagne Biotechnologies Alimentaires) animé par le Pôle Agronomique Ouest ADRO Ouest animé par le Pôle Agronomique Ouest Sociétés des produits de la mer et produits appertisés

Partenaires Partenaires industriels PME Centres R&D Sylvie Hallier Patrice Chablain Stéphane Bonilla Centres R&D Danièle Sohier Florence Postollec Ivan Leguérinel Florence Baron Michel Gauthier Sophie Jan

Développement d’un outil de diagnostic moléculaire BOARD : Objectifs détection & identification aliment Développement d’un outil de diagnostic moléculaire permettant, à partir de matrice alimentaire ou ingrédient, - la détection & identification de bactéries sporulées - la détermination de leur prévalence en IAA pour une meilleure analyse des risques et évaluation des dangers

Programme R&D Cahier des charges Sélection des genres, espèces cibles Alicyclobacillus, Anoxybacillus, Bacillus, Geobacillus, Moorella, Paenibacillus B. cereus, B. mycoides, B. pumilus, B. subtilis, B. licheniformis, B. thuringiensis, B. sporothermodurans, B. weihenstephanensis, B. laterosporus Seuil de détection > 10/g et résultats à J1 Enrichissement over-night Outil multi-cibles, avec des contraintes de coûts PCR multi-multicilbes plutôt qu’une biopuce….GeneDisc!

détecter une contamination Programme R&D Protocole Protocole d’extraction Protocole d’amplification Extraction PCR temps réel 25g aliment + diluant Enrichissement 20h, 37°C Objectif détecter une contamination < 10 spores/g

Programme R&D GeneDisc multi-cibles : Analyse des génomes Exploiter et séquencer ! Recherche de séquences cibles dans les bases de données & séquençage complémentaire Valider l’identification de la collection pour les tests de spécificité Valider les conditions d’enrichissement / Phylogénie Séquences cibles…

Programme R&D Arbre phylogénétique ANaérobie 55°C 30°C aérobie 37°C C. perfringens Brevibacillus laterosporus Paenibacillus B. cereus Alicyclobacillus acidoterrestris Moorella thermoacetica Anoxybacillus flavithermus Geobacillus stearothermophilus B. subtilis B. pumilus B. licheniformis B. circulans B. weihenstephanensis

Programme R&D 25g matrice + 100ml RCM Inoculation aux concentrations désirées 20h à 37°C anaerobiose 20h à 55°C aerobiose 20h à 30°C Extraction Détection & identification par PCR en temps réel

Programme R&D GeneDisc multi-cibles : Analyse des génomes Analyses et alignement des séquences Sélection de sondes oligonucléotidiques Optimisation des mélanges réactionnels

Programme R&D Deux GeneDisc GeneDisc1: Genres GeneDisc2: Bacillus spp. Paenibacillus, Anoxybacillus Geobacillus GeneDisc1: Genres Clostridium Moorella contrôles Deux GeneDisc B. cereus B. mycoides B. pumilus B. subtilis contrôles B. laterosporus Bacillus GeneDisc2: Bacillus spp. B. licheniformis B. thuringiensis B. sporothermodurans B. weihenstephanensis

Validation de la méthode Programme R&D Validation de la méthode Inclusivité et exclusivité Niveau de détection Exactitude Matrices artificiellement contaminées Matrices naturellement contaminées : dénombrement des spores et identification par séquençage

(Re) émergence de bactéries …Bactéries sporulées  Travaux en cours Perspectives & discussion  …Un bref état des lieux! 

Perspectives & discussion Prévalence des flores sporulées et analyse des dangers Evolution des GeneDisc en fonction de l’état des connaissances : description des espèces et acquisition de séquences BOARD : exemple concret de la génomique aux applications industrielles ! …ANR MEMOSPORE

Merci pour votre attention! Horror vacui… Bactéries sporulées : vers une adaptation aux process de production et de conservation ? « La nature a horreur du vide. Mais d’autant qu’il ne saurait y avoir d’espace vide en aucun endroit de l’univers, et que les parties de la matière, étant rondes, ne sauraient se rejoindre si étroitement ensemble, qu’elles ne laissent plusieurs petits intervalles au recoin entre elles : il faut que ces recoins soient remplis de quelques autres parties de cette matière. » Descartes, Principa philosophiae, 1644 Merci pour votre attention!

florence.postollec@adria.tm.fr sbonilla@genesystems.fr