Carcinogenèse colorectale: quelles nouveautés ? Bruno Buecher Cours intensif FFCD-BGDO – Lille, Novembre 2007

Les grandes “voies” de la carcinogenèse colorectale Etude des altérations génétiques somatiques “Anomalies quantitatives et qualitatives de l’ADN” Cytogénétique constitutionnelle Cytométrie en flux Génétique moléculaire ▪ Allélotypage ▪ Hybridation génomique comparative ▪ Painting chromosomique ▪ Recherche de mutation ▪ Etude de la méthylation

Les données de la cytogénétique conventionnelle Etude du caryotype des cancers colorectaux Tumeurs hyperploïdes – Altérations cytogénétiques nombreuses et complexes Tumeurs (para)-diploïdes – Pas ou peu d’altérations cytogénétiques Remvikos Y et al. Int J Cancer 1988; 42: 539-543

Les données de la cytométrie en flux (CMF) Détermination de l’index d’ADN de 138 cancers colorectaux Tumeurs hyperploïdes paradiploïdes Delattre O et al. Lancet 1989; 12: 353-355

Les données de la cytogénétique et de la CMF Etude du caryotype et du contenu en ADN (CMF) de 35 CCR humains  plusieurs prélèvements issus d’une même tumeur, dans 32 cas  analyse de « quelques » métastases hépatiques Fréquente hétérogénéité intra-tumorale Populations para-diploïdes exclusives: n=10 (29%) Une ou plusieurs populations hyperploïdes : n=19 (54%) Populations para- et hyperploïdes: n=6 (17%) Remvikos Y et al. Int J Cancer 1988; 42: 539-543

Les données de la cytogénétique et de la CMF index ADN pop. A / Index ADN pop.B = 2 La population hyperploïde dérive de la population para-diploïde par un mécanisme d’endoreduplication ou d’endomitose Remvikos Y et al. Int J Cancer 1988; 42: 539-543

La population hyperploïde est généralement largement majoritaire au niveau de la tumeur primitive au niveau des métastases hépatiques L’endo-reduplication est associée à un avantage sélectif Remvikos Y et al. Int J Cancer 1988; 42: 539-543

L’« allélotypage » Allélotype : étude extensive comparative (tumeur et tissu normal) de marqueurs polymorphes répartis sur les bras longs et courts des autosomes non acrocentriques (RFLP / VNTR / microsatellites) ► Pouvoir de « résolution » supérieur à celui du caryotype pour la recherche de perte de matériel chromosomique

Notion de pertes d’hétérozygotie (Loss of heterozygosity = LOH) L’« allélotypage » Notion de pertes d’hétérozygotie (Loss of heterozygosity = LOH) N T Amplification de 3 loci « informatifs » à partir de la muqueuse colique normale

Les données de l’« allélotypage » Allélotypage systématique de 56 cancers colorectaux Fréquence des pertes alléliques 5q 8p 17p 18q Fearon ER, Vogelstein B. Cell 1990; 61: 759-767

Les données de l’« allélotypage » et de la CMF Etude de 138 cancers colorectaux  Contenu en ADN  Pertes alléliques: 5q; 17p et 18q  Mutations K-ras LOH 17p 71/113 63% LOH 18 66/107 62% LOH 5q 38/98 39% Delattre O et al. Lancet 1989; 12: 353-355

Les données de l’« allélotypage » et de la CMF Association des anomalies génétiques entre elles  Association significative entre LOH 17p et LOH 18  L’hyperploïdie est significativement associée aux LOH 17p/18 L’hyperploïdie serait secondaire à une endomitose dans des cellules ayant perdu du matériel chromosomique Delattre O et al. Lancet 1989; 12: 353-355

Les données de l’« allélotypage » et de la CMF Fréquence des anomalies génétiques en fonction de la localisation tumorale L’hyperploïdie et les LOH 17p, 18 et 5q sont significativement plus fréquentes dans les tumeurs coliques distales Delattre O et al. Lancet 1989; 12: 353-355

Cinétique d’apparition des anomalies génétiques dans la séquence adénome / cancer Accumulation progressive d’anomalies génétiques au cours de la carcinogenèse Mutation K-ras = événement précoce LOH 17p = événement tardif Fearon ER, Vogelstein B. Cell 1990; 61: 759-767

Identification de gènes suppresseurs de tumeurs Pertes chromosomiques récurrentes gènes suppresseurs de tumeurs ? q p q Gène APC Gène DCC ? Gène SMAD4 ? Gène SMAD 2 ? Gène TP53

Instabilité génétique à l’échelle chromosomique La voie « LOH » Mutation K ras Mutation APC LOH 5q Gène « Gatekeeper » LOH tardives ENDOMITOSE LOH 18q Mutation TP53 LOH 17p Fearon ER and Vogelstein. Cell 1990; 61: 759-767 LOH = Loss of heterozygosity = Perte d’hétérozygotie = Perte de matériel chromosomique Instabilité génétique à l’échelle chromosomique

 perte de la fidélité de la réplication de l’ADN Identification d’une nouvelle voie de carcinogenèse à partir des données d’« allélotypage » Dans 5 cas (/56), identification de nouveaux allèles au niveau tumoral N T  perte de la fidélité de la réplication de l’ADN  intéressant préférentiellement les régions « répétitives » (sondes VNTR)  dans des tumeurs sans LOH Fearon ER, Vogelstein B. Cell 1990; 61: 759-767

L’instabilité génétique à l’échelle des nucléotides un mécanisme alternatif de carcinogenèse  Confirmation de l’existence de tumeurs présentant des nouveaux allèles au niveau de nombreux loci, notamment séquences répétitives  Faillite du complexe multiprotéique normalement impliqué dans la détection et la réparation des erreurs de réplication de l’ADN (système MMR, MisMatch Repair)  Phénotype « mutateur »: Taux de mutations: x 100 Instabilité microsatellitaire (IM = MSI) PCR fluorescente et électrophorèse capillaire PCR radioactive et autoradiographie

Le système Mismatch Repair MMR PMS2 MLH1 MSH2 MSH6 Addition de résidus dans le bras néo-formé ou résidus du bras copiés non appariés Anomalies normalement identifiées et corrigées par le S MMR Ensemble de gènes codant pour des protéines impliquées dans la reconnaissance et la réparation des mésappariements de l’ADN

L’instabilité génétique à l’échelle des nucléotides Quel est le mécanisme en cause ? Immunohistochimie Ac anti-MLH1 Muqueuse colique normale Cancers CCR MSI Amplification / PCR méthyS du promoteur du gène MLH1 U = unméthylated allele; M = methylated allele Muqueuse colique Nle Cancer colique MSI+ Défaut d’expression de la protéine hMLH1 par hyperméthylation du promoteur Herman JG et al. Proc Natl Acad Sci 1998; 95: 6870-6875

L’instabilité génétique à l’échelle des nucléotides Quelles sont les mutations somatiques récurrentes ? Gènes dont la séquence codante comporte des motifs répétitifs +++ ● Récepteur de type II du TGF-b (séquence répétée de 10 adénines) ● IGFII-R (séquence répétée de 08 guanines: GGGGGGGG) ● BAX (séquence répétée de 08 guanines: GGGGGGGG) ● b-caténine ● B-Raf (mutation ponctuelle V600E) ● Tcf4 ● Axine ● Caspase 5 ● E2F4 ● PTEN ...

Inactivation du gène MLH1 La voie « MSI » Inactivation du gène MLH1 (hyperméthylation de son promoteur) Mutation tardives Mutation BAX Mutation b-caténine Mutation TGFbRII Mutation Axine Mutation caspases

Les 2 voies de la carcinogenèse colorectale - Synthèse La voie « LOH » (80% des cas) Tumeurs hyperploïdes Pertes d’hétérozygoties: 17p ++; 18q ++; 5q Perte fonction APC, précoce, causale Tumeurs diploïdes ou paradiploïdes Mutations p53 Ø (peu) pertes d’hétérozygoties Mutations K-ras Ø de mutation APC ni p53 Localisation colique distale Localisation colique proximale Pronostic plus péjoratif Pronostic plus favorable Perte de la fidélité de la réplication de l’ADN hyperméthylation du promoteur hMLH1 ++ La voie « MSI » (15% des cas)

Les voies de signalisation impliquées dans la carcinogenèse colorectale

La voie de signalisation Wnt/b-caténine/APC c-myc Cycline D1 p21 Carcinogenèse « LOH » Inactivation bi-allélique APC Carcinogenèse « MSI » • Mutation activatrice de la b-caténine ou de Tcf • Mutation inactivatrice de l’axine

La voie de signalisation du TGF-b IGF-R Carcinogenèse « MSI » • Mutation TGFb-RII • Mutation IGF-R Carcinogenèse « LOH » • Mutations inactivatrices SMAD2 et SMAD4

La voie de signalisation Ras FdC P GRB2 SOS RAS-GDP RAS-GTP Raf MAPKK = MEK1/2 MAPK = ERK1/2 Facteurs de transcription Carcinogenèse « LOH » • Mutations activatrices de K-RAs Carcinogenèse « MSI » • Mutations activatrices B-Raf Activation constitutive de cette voie de signalisation

La protéine p53 = gardien du génome Carcinogenèse « LOH » • Inactivation biallélique de TP53 (LOH 17p et mutation) Carcinogenèse « MSI » • Mutations inactivatrices de B-Raf p53 Bax Gadd45 14-3-3-s p21 Apoptose Instabilité génomique cycline D +cdk 4/6 Arrêt en G1 Réparation de l’ADN cdc25 cycline B +cdk1 Arrêt en G2

A part, les formes héréditaires des cancers colorectaux La polypose adénomateuse familiale (hors « polypose associée à MYH ») ▪ Carcinogenèse de type « LOH » ▪ Mutation germinale délétère du gène APC Le syndrome HNPCC ▪ Carcinogenèse de type « MSI » ▪ Mutation germinale délétère d’un gène du système MMR: (MLH1, MSH2, MSH6)

Conclusion (1) • voie « LOH », majoritaire (80% des cas) 2 grandes voies de carcinogenèse colorectale « sporadique » • voie « LOH », majoritaire (80% des cas) • voie « MSI », minoritaire (15% des cas) Altération de 4 grandes voies de signalisation intracellulaires • voie de signalisation WNT-b caténine- APC   • voie de signalisation du TGFb • voie de signalisation de Ras • voie de « signalisation » de P53

Conclusion (2) Données récemment disponibles: complexité supérieure ▪ Voie(s) de carcinogenèse « non LOH; non MSI » ▪ Hétérogénéité de chacune des 2 voies connues de carcinogenèse colorectale. Démembrement en cours Intérêt de la connaissance des mécanismes de la cancérogenèse et de la caractérisation des altérations génétiques somatiques ▪ Valeur pronostique (phénotype MSI; LOH) ▪ Valeur prédictive de la réponse à la radiothérapie, à la chimiothérapie cytotoxique, aux thérapeutiques ciblées

A propos de l’instabilité des microsatellites (IM) Elle est spécifique des CCR survenant dans le contexte HNPCC Elle est dûe à une hyperméthylation du promoteur du gène MSH2 Elle doit être recherchée systématiquement chez tous les malades opérés d’un cancer colique ou rectal. Elle peut être recherchée uniquement à partir de tissus frais ou congelés Elle peut être recherchée à partir de tissus fixés et inclus en paraffine Elle peut être mise en évidence au niveau sanguin 1 2 3 4 ► 5 6

Quelles sont les propositions exactes ? L’IM serait associée à un meilleur pronostic et à une plus grande chimiosensibilité des tumeurs La LOH 18q serait associée à un pronostic plus péjoratif Les mutations de K-Ras seraient associées à une résistance au traitement par cétuximab L’inactivation d’un gène suppresseur de tumeur nécessite une invalidation bi-allélique 1 ► 2 3 4