Module 5. Prélever et préparer les échantillons de test de la charge virale PUBLIC VISÉ : toute personne intervenant dans le prélèvement, le traitement, la conservation et le transport des échantillons, dont les cliniciens, les techniciens de laboratoire, les préleveurs, le personnel chargé du transport des échantillons.

Objectifs d'apprentissage Connaître les types d’échantillons de test de la charge virale Comprendre le déroulement d'un prélèvement d'échantillon de sang veineux Comprendre le déroulement d’un prélèvement de gouttes de sang séché Décrire les éléments de sécurité biologique

Plan Échantillons sanguins pour les tests de la charge virale Prélèvement d'un échantillon de sang veineux Prélèvement d'un échantillon de gouttes de sang séché Sécurité biologique

Échantillons sanguins pour les tests de la charge virale Types d'échantillon : Plasma  Goutte de sang séché Le prélèvement des échantillons, le traitement et l’expédition vers le laboratoire d'analyse doivent être réalisés de manière à garantir l’intégrité de l’échantillon, la précision de la documentation et la sécurité biologique.

Utilisation des gouttes de sang séché comparativement au plasma pour le test de la charge virale Caractéristique Plasma Goutte de sang séché Nécessite une ponction veineuse Oui Non Nécessite une centrifugation Stable à « température ambiante » Oui* Risque biologique en cas de transport Nécessite de la glace sèche pour le transport Non* Utilisé systématiquement pour le génotypage Fourchette de volume 1 à 5 ml 0,25 à 0,5 ml Expliquez l’utilité des échantillons de gouttes de sang séché : Faciles à prélever Faciles à conserver Faciles à transporter Animez un débat sur les avantages respectifs des échantillons de plasma et de gouttes de sang séché dans les contextes propres aux participants. *S’il reste sec, pendant au moins deux semaines

Prélèvement d'un échantillon de sang veineux

Matériel nécessaire pour le prélèvement d’un échantillon de sang veineux Tubes de prélèvement Vacutainer Garrot Pansement Aiguille et support d'aiguille Vacutainer Conteneur à déchets piquants et tranchants Tubes Cryo (Nunc) Marqueur indélébile Gants non poudrés Tampon imbibé d'alcool Éponges de gaze

Échantillon de sang veineux - Prélèvement Il convient de porter des gants non poudrés lors du prélèvement sanguin. Le sang doit être prélevé uniquement dans un tube stérile enduit d’EDTA (bouchon violet). Prélevez environ 5 ml de sang chez le patient adulte dans un tube Vacutainer enduit d’EDTA. L'échantillon doit être analysé ou envoyé au laboratoire d'analyse dans un délai de 24 heures (de 6 heures dans l’idéal) à compter du prélèvement pour centrifuger le sang et en extraire le plasma.

Échantillon de sang veineux - Traitement Séparez le plasma par centrifugation à 800-1 600 x g pendant 20 minutes ou 2 450 x g pendant 10 minutes à température ambiante. Transférez le plasma dans un tube stérile en polypropylène (Cryo). Veillez à ne pas altérer la couche leuco-plaquettaire afin d'éviter toute contamination avec le matériel cellulaire. Transférez un volume minimal de 1,2 ml ou de 1 200 µl d'aliquotes d'échantillon dans chacun des deux tubes en polypropylène correctement étiquetés. Assurez-vous que les tubes en polypropylène sont bien refermés au moyen du bouchon à vis.

Échantillon de sang veineux - Conservation L’établissement en charge du traitement et du stockage des échantillons doit posséder son propre matériel et ses propres consommables. Conservez les échantillons de plasma entre 2 et 8 °C jusqu’à 5 jours ou congelez-les entre -20 et -70 °C ou à une température inférieure. Les échantillons de plasma peuvent être stockés pendant 24 heures seulement à une température comprise entre 15 et 30 °C. S'ils doivent être conservés plus longtemps, les échantillons de plasma doivent être stockés à -70 ° C. Durée de conservation Type d'échantillon Température de conservation 37 °C 15 à 30 °C 4 °C -20 °C -70 °C Sang total 24 h S/O Plasma 5 jours 1 an 5 ans

Échantillon de sang veineux - Transport Les échantillons doivent être protégés contre les dommages mécaniques, les chocs thermiques et les altérations. Pour préserver l’intégrité de l'échantillon : Le sang total doit être transporté à une température comprise entre 2 et 25 °C et traité dans les 24 heures suivant le prélèvement. Le plasma peut être transporté à une température comprise entre 2 °C et 8 °C ou congelé entre -20 °C et -70 °C. Assurez-vous que les règles de sécurité sont bien respectées. Triple emballage

Triple emballage Récipient primaire Contient l'échantillon. Doit être hermétique et parfaitement étanche. Son contenu doit être indiqué sur une étiquette. Enveloppé dans un volume suffisant de matériau absorbant pour qu’en cas de bris ou de fuite, tout le liquide de l’échantillon soit absorbé. Emballage secondaire Renferme et protège le récipient primaire. Doit être étanche et à l'épreuve des fuites. Plusieurs récipients primaires enveloppés de matériau absorbant peuvent être placés dans un même emballage secondaire. Emballage extérieur Protège l’emballage secondaire contre les dommages matériels qui pourraient se produire au cours du transport. Contient des formulaires contenant des données sur l’échantillon, des documents ou autres types d’information qui en indiquent la nature, en donnent la description, avec mention du nom de l’expéditeur et du destinataire, ainsi que tout document complémentaire requis. Il doit s'agir d’un contenant rigide muni d'un verrou ou pouvant être fermé à l’aide de scotch.

Échantillon de sang veineux - Critères de rejet Échantillons de plasma congelés et décongelés plus de cinq fois avant l'analyse Volume d’échantillon insuffisant Échantillon coagulé Échantillons de plasma non conservés à une température appropriée pendant le transport Échantillons lipémiques et hémolysés Contamination possible Tubes échantillons mal ou non étiquetés Mauvaise séparation du plasma Échantillons de plasma NON séparés dans les 24 h suivant le prélèvement Échantillon ou formulaire de demande d'analyse de laboratoire manquant Échantillons prélevés avec un anticoagulant autre que l’EDTA (HÉPARINE ou ACD) Échantillons de plasma NON congelés pendant plus de cinq jours avant d’être analysés

Échantillon de sang veineux - Critères de rejet Sérum et plasma valides Lipémique Hémolysé Contaminé

Prélèvement d'un échantillon de gouttes de sang séché

Matériel nécessaire pour le prélèvement de gouttes de sang séché Sachets plastiques résistants à l'humidité à fermeture à glissière Gants (non poudrés) Papier buvard Whatman 903 Marqueur waterproof Rack de séchage du papier Papier pour la séparation des échantillons Lancette rétractable Récipient et sac pour déchets biologiques à placer sur la paillasse Tampon imbibé d'alcool Compresse de gaze stérile sèche Conteneur à déchets piquants et tranchants Dessicant Indicateurs d’humidité Stylo

Prélèvement d'échantillons de gouttes de sang séché Observez les précautions universelles de sécurité. L'utilisation de fiches de prélèvement de gouttes de sang séché homologuées et perforées est vivement recommandée. Étiquetez clairement la fiche de prélèvement avec le numéro d'identification correspondant. Il convient de porter des gants non poudrés lors du prélèvement sanguin. Le sang peut être prélevé à partir d'une piqûre au doigt ou au talon ou d'une ponction veineuse en utilisant un tube stérile enduit d’EDTA (bouchon violet). Si nécessaire, le sang en contact avec l’anticoagulant EDTA peut être conservé jusqu'à 24 heures avant la préparation des gouttes de sang séché, de préférence à 4 °C. Appliquez cinq cercles remplis de sang directement sur le papier buvard ou utilisez une pipette en cas de prélèvement de sang veineux.

Conseils pour le prélèvement de gouttes de sang séché Ne touchez pas les zones de la fiche de prélèvement qui serviront à recueillir les échantillons, que vous portiez des gants ou non. N'appliquez pas de sang des deux côtés du papier buvard. N’appliquez pas de sang en plusieurs fois sur le même cercle de prélèvement. N’appliquez pas de sang de plusieurs patients sur une même fiche de prélèvement. N'appuyez pas le papier buvard contre le site de ponction. Ne pressez pas la pulpe du doigt pour en extraire le sang. Présentez les conseils suivants : N’APPUYEZ PAS le papier buvard contre le site de ponction. Appliquez le sang d'un seul côté du papier buvard. N’appliquez pas de sang en plusieurs couches successives ni en plusieurs fois sur le même cercle de prélèvement. Ne pressez pas la pulpe du doigt pour en extraire le sang car un pressage ou un pincement excessifs du site de ponction pourrait entraîner une hémolyse de l’échantillon ou le prélèvement de liquides tissulaires avec l'échantillon, ce qui pourrait affecter le résultat du test. (REMARQUE : « hémo- » signifie globules rouges, « -lyse » destruction, « hémolyse » destruction des globules rouges.)

Échantillon de gouttes de sang séché - Conservation Il convient de laisser sécher les échantillons de gouttes de sang séché à l’air libre avant de les emballer, de préférence pendant 4 heures ou jusqu’au lendemain. Les échantillons devraient être conservés dans un sac en plastique étanche à l’air avec fermeture à glissière contenant un dessicant et un indicateur d'humidité. Évitez de laisser les fiches de gouttes de sang séché à température ambiante pendant plus d'une semaine. Évitez l’exposition à la lumière directe du soleil et à la chaleur. Les fiches doivent comporter une étiquette incluant les identifiants appropriés.

Échantillon de gouttes de sang séché - Transport Préservez l’intégrité de l'échantillon Surveillez la température lors du transport Surveillez l'état de l’indicateur d'humidité Limite de temps Assurez-vous que les règles de sécurité sont bien respectées Traitez les gouttes de sang séché comme un matériau présentant un risque biologique (mais ne nécessitant pas de triple emballage)

Échantillon de gouttes de sang séché : échantillon conforme Les données d'identification figurant sur la fiche de prélèvement des gouttes de sang séché doivent être claires et correspondre aux documents joints. Au moins trois grosses gouttes doivent être obtenues. Les échantillons doivent remplir les cercles et être aussi centrés que possible, en particulier en cas de fiches perforées. Après séchage, les gouttes de sang séché doivent être de couleur foncée et uniforme, témoignant d’une technique appropriée de prélèvement et de séchage. Chaque échantillon analysé doit remplir les critères suivants

Échantillon de gouttes de sang séché : critères de rejet Volume d'échantillon insuffisant/cercles incomplets Échantillon coagulé Hémolyse/anneau de sérum Abrasé/rayé Pas sec/emballé avant séchage Mauvais contrôle de l’humidité Échantillons mal étiquetés ou non étiquetés Échantillon ou formulaire de demande d'analyse de laboratoire manquant

Critères de rejet : identification illisible Problème : les données d'identification sont illisibles ; cet échantillon ne doit pas être analysé. Quelles solutions suggéreriez-vous pour remédier à ce problème ?

Critères de rejet : identification illisible Solutions : Étiquetez la fiche de prélèvement de gouttes de sang séché clairement avant de procéder au prélèvement de l’échantillon. Si le nom est illisible, un autre échantillon est nécessaire. Le laboratoire rejettera ces échantillons.

Critères de rejet : quantité insuffisante de sang. Problème : ces gouttes ne contiennent pas suffisamment de sang à analyser. N’oubliez pas, au mois 3 GROSSES GOUTTES sont nécessaires pour réaliser l'analyse. Quelles solutions suggéreriez-vous pour remédier à ce problème ?

Critères de rejet : quantité insuffisante de sang. Solutions : En cas de piqûre au doigt ou au talon, vérifiez que la zone est chaude et positionnée de manière à ce que le sang s'écoule facilement pour le prélèvement de l'échantillon. N'appliquez pas de pression directement sur le site de la piqûre mais appuyez sur l’ensemble du pied ou de la main. Si le sang a cessé de couler du site de la piqûre, une seconde piqûre sur un autre site peut s'avérer nécessaire. Un prélèvement veineux peut être nécessaire chez une personne malade ou déshydratée. Assurez-vous que la pipette est réglée sur 70 µl. Quelles solutions suggéreriez-vous pour remédier à ce problème ?

Critères de rejet : sang coagulé ou dépôts successifs Problèmes : On remarque que les gouttes sont plus foncées au centre. Cela survient lorsque l'on applique du sang mouillé par dessus du sang séché. Cela peut également être le cas si le sang utilisé est coagulé. Quelles solutions suggéreriez-vous pour remédier à ce problème ?

Critères de rejet : sang coagulé ou dépôts successifs Solutions : Approchez la fiche de la goutte de sang lorsqu’elle semble suffisamment grosse et prête à tomber. Cela représente la quantité adéquate de sang. Si une goutte est trop petite, mais qu’elle n’est pas encore sèche, une autre goutte peut être placée au-dessus. Dans le cas contraire, passez à une autre goutte. N'utilisez jamais de sang en train de coaguler ou déjà coagulé pour effectuer un prélèvement de gouttes de sang séché. Quelles solutions suggéreriez-vous pour remédier à ce problème ?

Critères de rejet : anneaux de sérum/contamination par de l’alcool Problèmes : L'anneau jaune autour des gouttes de sang indique que le sang est contaminé ou séparé. Il est possible que l’alcool n’ait pas séché. Cela peut survenir en cas de pression au niveau du site de ponction - ce qui fait sortir le plasma au lieu du sang. Cela peut également être provoqué par un mélange insuffisant ou inexistant du tube EDTA avant le prélèvement de la goutte. Quelles solutions suggéreriez-vous pour remédier à ce problème ?

Critères de rejet : anneaux de sérum/contamination par de l’alcool Solutions : Après avoir nettoyé la zone, laissez l’alcool sécher pendant 30 secondes avant d’effectuer la prise de sang ou la piqûre. Veillez à presser doucement la totalité de la main ou du pied pour favoriser le flux sanguin. Ne pressez pas et ne pincez pas directement le site pour en extraire le sang. Si les gouttes de sang séché sont formées à partir d'un tube EDTA, veillez à retourner le tube plusieurs fois pour mélanger le sang avant le pipetage. Quelles solutions suggéreriez-vous pour remédier à ce problème ?

Critères de rejet : quantité trop importante de sang Problèmes : Le sang peut avoir été appliqué avec une seringue ou avec une pipette mal réglée. Le sang a traversé le papier. Quelles solutions suggéreriez-vous pour remédier à ce problème ?

Critères de rejet : quantité trop importante de sang Solutions : Utilisez un tube EDTA pour la ponction veineuse. Utilisez un réglage approprié de la pipette au bon volume pour former les gouttes de sang séché. Ne la remplissez pas excessivement. Quelles solutions suggéreriez-vous pour remédier à ce problème ?

Critères de rejet : mauvaise technique de prélèvement. Problèmes : Le sang peut avoir coagulé lorsqu’il a goutté sur la fiche. Plusieurs gouttes de sang ont été appliquées dans chaque cercle. Aucun des cercles n’a été rempli correctement. Quelles solutions suggéreriez-vous pour résoudre ce problème ?

Critères de rejet : mauvaise technique de prélèvement. Solutions : Attendez qu’une grosse goutte se forme avant de toucher le papier. Une goutte de sang qui tombe d’elle-même est de taille idéale. Ne touchez jamais la peau, une aiguille, une seringue ni l’embout d'une pipette avec le papier lorsque vous appliquez le sang. Quelles solutions suggéreriez-vous pour résoudre ce problème ?

Sécurité biologique

Sécurité biologique Toute personne qui manipule des échantillons sanguins lors de l’une des étapes du prélèvement, du traitement et du transport doit respecter les mesures de sécurité standard relatives à la manipulation des matériaux biologiques potentiellement infectieux. Il est possible de réduire l’exposition aux risques biologiques en associant des pratiques et procédures sûres, des infrastructures sécurisées et l'équipement de sécurité qui permette de maîtriser les risques biologiques. Il convient de se conformer aux procédures opératoires normalisées présentées par les services nationaux responsables des laboratoires relatives à l’utilisation des équipements de protection individuelle, la décontamination des accessoires réutilisables tels que les glacières, et la décontamination et l’élimination des déversements de substances et des déchets présentant un risque biologique.

Sécurité biologique En cas de déversement accidentel, le transporteur des échantillons devrait gérer le déversement conformément aux protocoles standard de traitement des substances présentant un risque biologique. En cas de déversement et de retard de livraison, un rapport d'incident doit être complété dans le formulaire de suivi de l’échantillon aux fins d'assurance qualité. Les cliniciens organisant le transport des échantillons devraient suivre les procédures opératoires normalisées applicables à ce processus.

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