Etablissement de tests de diagnostic moléculaire spécifiques de Gnomoniopsis smithogilvyi et Cryphonectria parasitica. Matteo Conti1, Julien Crovadore1, Joana Beatrice Meyer2, Bastien Cochard1, Romain Chablais1, Simone Prospero2, Mauro Jermini3 & François Lefort1. 1Groupe Plantes et pathogènes, Institut Terre Nature et Environnement, hepia, HES-SO//Genève 150 route de Presinge, 1254 Jussy, Suisse. E-mail: francois.lefort@hesge.ch 2Unité de recherche Biodiversité et écologie de la conservation, Institut fédéral de recherches sur la forêt, la neige et le paysage WSL, Zürcherstrasse 111, 8903 Birsmendorf, Suisse 3Agroscope, Cadenazzo Research Centre, A Ramél 18, 6593 Cadenazzo, Switzerland Résultats Deux champignons causent des maladies du châtaignier (Castanea sativa) en Suisse: Cryphonectria parasitica, l’agent du chancre du châtaignier, arrivé au Tessin dans les années 1940, et maintenant endémique, et Gnomoniopsis smithogilvyi, un champignon, récemment identifié en Europe et en Suisse, comme le principal agent de pourriture de la châtaigne mais également comme un agent de chancre du châtaignier. Ce dernier est un champignon endophyte pouvant devenir pathogène dans des conditions non encore décrites. Il semble également être le principal responsable de la forte mortalité survenant précocement dans les jeunes vergers fruitiers. Les conditions d’amplification optimale pour les deux paires d’amorce développées ont été recherchées. Les tests de développement ont été effectués avec des échantillons d’ADN de deux isolats de G. smithogilvyi provenant du Tessin et de Genève et d’un isolat de Cryphonectria parasitica, du Tessin. Ces tests ont montré une grande robustesse et représentent un outil intéressant pour qualifier le statut phytosanitaire de matériel de multiplication, en particulier pour G. smithogilvyi, qui a la particularité d’être endophyte.  Matériel et méthodes Afin d’évaluer la présence de ces deux champignons dans le matériel végétal utilisé pour la multiplication de six variétés de châtaigniers au Tessin, un test de diagnostic moléculaire a été développé spécifiquement pour chacune de ces deux espèces. Dans ce but, trois régions de l’ADN des deux champignons ont été analysées pour y rechercher des différences entre eux, mais aussi entre tous les champignons connus. Toutes les séquences disponibles dans GenBank pour l’espaceur transcrit interne de l’ADN ribosomal, pour le gène du facteur d’élongation 1-alpha et pour le gène de la beta-tubuline ont été collectées pour ces deux espèces. Après alignement et analyse de 164 séquences ITS, 90 séquences pour le gène du facteur d’élongation 1-alpha et 45 séquences du gène de la beta-tubuline, seul l’alignement des séquences du gène de la beta-tubuline a permis d’obtenir des différences de séquences significatives pour les deux espèces, garantissant la spécificité des amorces d’amplification. Des amorces PCR spécifiques pour chaque espèce ont été développées sur la base ces analyses d’alignements de séquences. Les analyses in silico menées par BLAST (GenBank) ont aussi confirmé la stricte spécificité de ces amorces. Figure 2.  Test de spécificité des amorces spécifiques de G. smithogilvyi (GS) et C. parasitica (CP). Figure 3.  Détermination de la concentration ADN optimale pour l’amplification. Figures 5 et 6. Gels d’éléctrophorèse obtenus en analysant des galles venant du Valais. Figure 4.  Détermination de la température d’hybridation optimale des amorces d’amplification. Validation des tests moléculaires Figure 1. Alignement des séquences de la région du gène de la beta-tubuline retenue pour le test: séquences de Gnomoniopsis smithogilvyi, Gnomoniopis spp. et Cryphonectria parasitica. Une fois développés, les tests ont été validés avec des échantillons d’ADN extraits de galles de cynips et de chancre sur châtaigniers provenant du Valais et du Tessin, préalablement caractérisés. G. smithogylvyi a été détecté dans tous les échantillons et C. parasitica dans aucun. Après validation les tests ont été utilisés pour analyser des échantillons d’ADN provenant de racines et de tiges de châtaignes germées ou de feuilles de châtaigniers (voir poster sur la prévalence de G. smithogilvyi). Les primers spécifiques de Gnomoniopsis smithogilvyi GSF et GSR permettent d’amplifier des amplicons de 264 paires de bases. Les primers spécifiques de Cryphonectria parasitica, permettent d’amplifier un amplicon de 322 paires de bases. La différence de taille entre les deux amplicons est aisément observable après séparation par électrophorèse. Détermination des conditions optimales des tests Conclusion Différents essais ont été menés pour déterminer les conditions d’amplification optimales avec les deux paires d’amorces. Ces conditions sont: Concentration d’ADN à 50 ng/μl. Température d’hybridation de 58°C pour les deux paires d’amorces. L’amplification est néanmoins possible entre 55 et 65°C Deux tests de diagnostic moléculaire spécifiques ont été développés et validés pour Gnomoniopsis smithogilvyi et Cryphonectria parasitica. L’objectif était de disposer d’un outil permettant de détecter la présence de ces deux espèces de champignons. Les tests se sont révélés efficaces pour détecter la présence de Gnomoniopsis smithogilvyi, en tant qu’endophyte, dans plusieurs organes de châtaignier. Par contre Cryphonectria parasitica n’a jamais été détecté comme endophyte. JOURNEE D'AUTOMNE SGP / SSP 2016 Interactions complexes entre plantes et organismes nuisibles Jeudi 27 octobre 2016, HAFL Zollikofen