Identification et caractérisation de facteurs de transcriptions appartenant à la famille des régulateurs de réponse de type B, impliqués dans la réponse à la sécheresse chez le peuplier par Inès DJEGHDIR Laboratoire de Biologie des Ligneux et des Grandes Cultures - UPRES EA 1207 LBLGC Directeur de Thèse: Dr. Sabine CARPIN, LBLGC Université d’Orléans Co-encadrement: Dr. Audrey OUDIN , BBV Université de Tours

Problématique de l’équipe d’accueil du LBLGC Equipe ARCHE 3 équipes dont l’équipe ARCHE: Arbres et Réponses aux Contraintes Hydriques et Environnementales Réponse des arbres aux contraintes environnementales: Différentes approches: Ecophysiologique Épigénétique Protéomique Signalisation Voie commune aux végétaux et aux levure: Phosphorelais Multiple peuplier sécheresse

Le phosphorelais multiple 3 partenaires: Récepteur ou Histidine-aspartate Kinase : HK Protéines de relais de phosphate ou Histidine Phosphotransfer protein : HPt Régulateurs de Réponse : RR N C H D HPt RR

Partenaires du phosphorelais multiple chez Populus sp. Cytokinines Contrainte osmotique 1 HK2 2 HK3 2 HK4 Paroi cellulaire N C H HK1 D N C H HK1 D N C H D N H C D Membrane plasmique 10 HPt 12 RR-B Enlever ckinines Décomposer phosphorelai en ajoutant les ref pour chacun des partenaires: hericourt et al 2013 HK1/HpT Bertheau et al 2012 RR et chefdor et al 2006 pour le HK1 Decrire le système et dire ce qui est connu…. Terminer sur les rr Noyau Chefdor et al., 2006, Bertheau et al., 2012, Héricourt et al., 2013

Partenaires du phosphorelais multiple chez Populus sp. Contrainte osmotique Paroi cellulaire N C H HK1 D N C H HK1 D Membrane plasmique P HPt HPt P P RR-B HPt Enlever ckinines Décomposer phosphorelai en ajoutant les ref pour chacun des partenaires: hericourt et al 2013 HK1/HpT Bertheau et al 2012 RR et chefdor et al 2006 pour le HK1 Decrire le système et dire ce qui est connu…. Terminer sur les rr Noyau Chefdor et al., 2006, Bertheau et al., 2012, Héricourt et al., 2013

Etat de l’Art au laboratoire HK1 analogue de AHK1 d’Arabidopsis (Chefdor et al., 2006) Récepteur HK1 isolé = osmosenseur potentiel (Chefdor et al., 2006) capable de dimériser (Héricourt et al., 2013) H AHK1 D N C HK1 65% d’identité 82% de similarités Chefdor et al 2006

Etat de l’Art au laboratoire 3 HPt sont les partenaires préférentiels de HK1 (Héricourt et al., 2013) A gauche: après double hybride en levure, Activité béta gal mesurée pour HK1 CP face à chaque HPt (Hericourt et al 2013) A droite: HPt 2, 7 et 9 sont les HPt majoritairement impliquées dans l’osmosensing

Etat de l’Art au laboratoire Les 8 RR-B isolés interagissent avec les 3 HPt précédentes (Bertheau et al., 2012) Ces RR sont-ils fonctionnels chez le Peuplier?

Stage de Master II Choix du RR13 : Stratégie de recherche: Homologue Arabidopsis : rôle prépondérant dans le développement de la plante Chez Peuplier : RR le plus fortement exprimé et présentant de fortes interactions avec les 3 HPt partenaires de HK1 (Bertheau et al., 2012) importance probable de ce RR Stratégie de recherche: Evaluer la fonctionnalité du RR13 Fixation du GARP-RR13 sur l’ADN Activation de la transcription de gènes régulés par la contrainte osmotique: HK1 et dhn1 Caractériser la régulation de l’expression des gènes RR13, HK1, dhn1 lors de la contrainte osmotique

Stage de Master II Stratégie de recherche: Evaluer la fonctionnalité du RR13 Fixation du GARP-RR13 sur l’ADN N N C Domaine receveur : Motif DDK Domaine GARP, fixation à l’ADN : reconnaissance de boites spécifiques chez Arabidopsis (Sakai et al., 2000 ; Sakai et al., 2001) Domaine de transactivation

Evaluer la fonctionalité du RR13 Fixation du GARP-RR13 sur l’ADN AV0 + - GST-GARP : + - ERF + - Fixation spécifique sur les sondes AVO et AV2 possédant des boites spécifiques

Evaluer la fonctionalité du RR13 Activation de la transcription de gènes régulés par la contrainte osmotique: HK1 et dhn1 Test de transactivation d’un gène de RRA Arabidopsis (ARR6) par fixation du RR13 sur son promoteur (ARR2 (RR-B) d’ Arabidopsis utilisés en contrôle) Luc ARR2 RR13 Promoteur ARR6 * Augmentation de l’activité du promoteur ARR6 avec le même niveau d’efficacité que le contrôle positif (ARR2) Le RR13 est un facteur de transcription fonctionnel

Caractériser la régulation de l’expression des gènes RR13, HK1, dhn1 lors de la contrainte osmotique Diminution de la conductance stomatique = fermeture des stomates, perception de la contrainte et mise en place d’une réponse

Caractériser la régulation de l’expression des gènes RR13, HK1, dhn1 lors de la contrainte osmotique 5 10 15 20 25 30 *** * ** T0 T5 T10 T20 T40 T60 T120 T180 T360 Expression de HK1 dans les racines au cours du temps T0 T5 T10 T20 T40 T60 T120 T180 T360 0,5 1 1,5 2 2,5 Expression de HK1 dans les feuilles au cours du temps ** Expression du RR13 dans les feuilles au cours du temps 5 10 15 20 25 30 T0 T5 T10 T20 T40 T60 T120 T180 T360 Expression du RR13 dans les racines au cours du temps ** * *** 10 *** 8 6 * *** * *** 4 * *** 2 T0 T5 T10 T20 T40 T60 T120 T180 T360

Projet de recherche Objectifs : Identification des RR de type B spécifiquement impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique Caractérisation de l’activité transcriptionnelle des RR de type B candidats Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels

Projet de recherche Identification des RR de type B spécifiquement impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique Technique: qPCR sur les 8 RR-B sur des échantillons stressés

Projet de recherche Caractérisation de l’activité transcriptionnelle des RR de type B candidats Techniques: - Gel retard ou EMSA - Délétion de promoteurs et mutagénèse des boites de fixation + GARP ?

Projet de recherche Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels Techniques: Double hybride après criblage de banque ou interaction ciblée 1 2

Merci de votre attention

Le phosphorelais de levure Données supplémentaires Le phosphorelais de levure Condition témoin N C H D SLN1 Membrane plasmique ATP P YPD1 cytoplasme P inactive P SSK1 Voie HOG

Le phosphorelais de levure Données supplémentaires Le phosphorelais de levure Osmolarité forte N C H D SLN1 Membrane plasmique SSK1 YPD1 activé cytoplasme ATP SSK2 P Voie HOG P HOG1

Transformation par biolistique Données supplémentaires Transformation par biolistique Contrôle interne Promoteur ARR6 RR B ARR- 2 35S GUS UBI LUC ARR6 Contrôle positif ou + + RR- 13 35S => études d’expression des gènes codant des RR de type B par …. (racines, tiges, pétioles et feuilles) soumis ou non à une contrainte osmotique. => Les facteurs de transcription seront surexprimés et introduits de manière transitoire par biolistique dans les cellules de peuplier. Leur capacité de transactivation de gènes impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique sera étudiée. Cette seconde étape permettra de démontrer que ces facteurs de transcription régulent directement des gènes de réponse des plantes à la sécheresse. En effet, une toute récente étude vient de montrer pour la première fois que l’activité trans-régulatrice de RR-18, un RR de type B de la voie de signalisation des cytokinines chez Arabidopsis thaliana nécessite son homodimérisation (Veerabagu et al., 2012). 3. Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels potentiellement impliqués dans la régulation des gènes permettant l’adaptation des peupliers à la sécheresse Condition test

Exemple de gènes régulés lors de la contrainte hydrique Données supplémentaires Exemple de gènes régulés lors de la contrainte hydrique Enzymes de détoxication et composés anti-oxydants : - SOD (SuperOxyde Dismutase), CAT (CATalase), GPx (Gluthatione PeroXydase) - acide ascorbique, glutathion … Osmoprotectants: - certains acides aminés : proline - des dérivés d’acides aminés : glycine - des sucres et des polyols : raffinose, mannitol… Aquaporines : protéines membranaires formant un pore permettant le passage de l’eau et d’autres solutés HSP et chaperonnes: - HSP 70, … - chaperonines Implication majeure dans la renaturation ou la dégradation des protéines agrégées lors des stress => études d’expression des gènes codant des RR de type B par …. (racines, tiges, pétioles et feuilles) soumis ou non à une contrainte osmotique. => Les facteurs de transcription seront surexprimés et introduits de manière transitoire par biolistique dans les cellules de peuplier. Leur capacité de transactivation de gènes impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique sera étudiée. Cette seconde étape permettra de démontrer que ces facteurs de transcription régulent directement des gènes de réponse des plantes à la sécheresse. En effet, une toute récente étude vient de montrer pour la première fois que l’activité trans-régulatrice de RR-18, un RR de type B de la voie de signalisation des cytokinines chez Arabidopsis thaliana nécessite son homodimérisation (Veerabagu et al., 2012). 3. Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels potentiellement impliqués dans la régulation des gènes permettant l’adaptation des peupliers à la sécheresse

Données supplémentaires Les Dehydrines Définition: - famille LEA (Late Embryogenesis Abundant proteins) - accumulation dans les plantes durant les étapes tardives de l’embryogenèse ou en réponse au stress environnementaux. Structure: - présence ou absence d’un segment Y - segment S: Présence ou absence d’un domaine à Sérines phosphorylables - segment K : hélice(s) alfa - segments φ: riche en glycine ou acides aminés polaires Absence de résidus cystéine ou tryptophane => études d’expression des gènes codant des RR de type B par …. (racines, tiges, pétioles et feuilles) soumis ou non à une contrainte osmotique. => Les facteurs de transcription seront surexprimés et introduits de manière transitoire par biolistique dans les cellules de peuplier. Leur capacité de transactivation de gènes impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique sera étudiée. Cette seconde étape permettra de démontrer que ces facteurs de transcription régulent directement des gènes de réponse des plantes à la sécheresse. En effet, une toute récente étude vient de montrer pour la première fois que l’activité trans-régulatrice de RR-18, un RR de type B de la voie de signalisation des cytokinines chez Arabidopsis thaliana nécessite son homodimérisation (Veerabagu et al., 2012). 3. Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels potentiellement impliqués dans la régulation des gènes permettant l’adaptation des peupliers à la sécheresse

Données supplémentaires Les Dehydrines Propriétés: - 5 sous groupes de déhydrines : YnSK2, SKn, KnS, Y2Kn et Kn - solubilités en solution aqueuse à 100°C - localisation cytoplasmique, mitochondriale ou nucléaire - protéines hydrophiles mais contenant une hélice alpha amphiphiles liant les lipides. fixation possible aux lipides membranaires de petites vésicules - gènes inductibles par différents types de stress abiotiques => études d’expression des gènes codant des RR de type B par …. (racines, tiges, pétioles et feuilles) soumis ou non à une contrainte osmotique. => Les facteurs de transcription seront surexprimés et introduits de manière transitoire par biolistique dans les cellules de peuplier. Leur capacité de transactivation de gènes impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique sera étudiée. Cette seconde étape permettra de démontrer que ces facteurs de transcription régulent directement des gènes de réponse des plantes à la sécheresse. En effet, une toute récente étude vient de montrer pour la première fois que l’activité trans-régulatrice de RR-18, un RR de type B de la voie de signalisation des cytokinines chez Arabidopsis thaliana nécessite son homodimérisation (Veerabagu et al., 2012). 3. Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels potentiellement impliqués dans la régulation des gènes permettant l’adaptation des peupliers à la sécheresse

Données supplémentaires Les Dehydrines Rôles probables : - stabilisation des structures endomembranaires lors de stress abiotiques segments K - rôle de protection contre les radicaux libres par certaines déhydrines - rôle de protection lors de la déshydratation des graines. => études d’expression des gènes codant des RR de type B par …. (racines, tiges, pétioles et feuilles) soumis ou non à une contrainte osmotique. => Les facteurs de transcription seront surexprimés et introduits de manière transitoire par biolistique dans les cellules de peuplier. Leur capacité de transactivation de gènes impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique sera étudiée. Cette seconde étape permettra de démontrer que ces facteurs de transcription régulent directement des gènes de réponse des plantes à la sécheresse. En effet, une toute récente étude vient de montrer pour la première fois que l’activité trans-régulatrice de RR-18, un RR de type B de la voie de signalisation des cytokinines chez Arabidopsis thaliana nécessite son homodimérisation (Veerabagu et al., 2012). 3. Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels potentiellement impliqués dans la régulation des gènes permettant l’adaptation des peupliers à la sécheresse

Données supplémentaires Les Aquaporines protéines membranaires de 25 à 30kDa présentes dans tout les organismes du monde vivant (35 chez Arabidopsis, 31 chez Zea mays) et dont certaines sont constitutives plusieurs sous familles 6 domaines transmembranaires et 2 extrémités cytoplasmiques identiques 2 à 2 peptide caractéristique : NPA formant un canal à eau grande conservation des acides aminés formant le pore aqueux formation de tétramères où chaque monomère est un canal à eau certaines sont eau spécifique, glycérol spécifique et d’autres sont mixtes 1 2 3 4 5 N P A H2N HOOC S Canal à eau Domaines de phosphorylation cytoplasme Apoplasme ou vacuole => études d’expression des gènes codant des RR de type B par …. (racines, tiges, pétioles et feuilles) soumis ou non à une contrainte osmotique. => Les facteurs de transcription seront surexprimés et introduits de manière transitoire par biolistique dans les cellules de peuplier. Leur capacité de transactivation de gènes impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique sera étudiée. Cette seconde étape permettra de démontrer que ces facteurs de transcription régulent directement des gènes de réponse des plantes à la sécheresse. En effet, une toute récente étude vient de montrer pour la première fois que l’activité trans-régulatrice de RR-18, un RR de type B de la voie de signalisation des cytokinines chez Arabidopsis thaliana nécessite son homodimérisation (Veerabagu et al., 2012). 3. Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels potentiellement impliqués dans la régulation des gènes permettant l’adaptation des peupliers à la sécheresse

Données supplémentaires Les Aquaporines régulation du flux d’eau via leur phosphorylation par une protéine kinase calcium dépendante membranaire expression fortement corrélée aux cellules associées au flux d’eau certains gènes peuvent être soit sur, soit sous-exprimés par la sécheresse la méthylation peut les réguler => études d’expression des gènes codant des RR de type B par …. (racines, tiges, pétioles et feuilles) soumis ou non à une contrainte osmotique. => Les facteurs de transcription seront surexprimés et introduits de manière transitoire par biolistique dans les cellules de peuplier. Leur capacité de transactivation de gènes impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique sera étudiée. Cette seconde étape permettra de démontrer que ces facteurs de transcription régulent directement des gènes de réponse des plantes à la sécheresse. En effet, une toute récente étude vient de montrer pour la première fois que l’activité trans-régulatrice de RR-18, un RR de type B de la voie de signalisation des cytokinines chez Arabidopsis thaliana nécessite son homodimérisation (Veerabagu et al., 2012). 3. Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels potentiellement impliqués dans la régulation des gènes permettant l’adaptation des peupliers à la sécheresse

Le PolyEthylène Glycol Données supplémentaires Le PolyEthylène Glycol => études d’expression des gènes codant des RR de type B par …. (racines, tiges, pétioles et feuilles) soumis ou non à une contrainte osmotique. => Les facteurs de transcription seront surexprimés et introduits de manière transitoire par biolistique dans les cellules de peuplier. Leur capacité de transactivation de gènes impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique sera étudiée. Cette seconde étape permettra de démontrer que ces facteurs de transcription régulent directement des gènes de réponse des plantes à la sécheresse. En effet, une toute récente étude vient de montrer pour la première fois que l’activité trans-régulatrice de RR-18, un RR de type B de la voie de signalisation des cytokinines chez Arabidopsis thaliana nécessite son homodimérisation (Veerabagu et al., 2012). 3. Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels potentiellement impliqués dans la régulation des gènes permettant l’adaptation des peupliers à la sécheresse

Phosphorylation de l’Histidine Données supplémentaires Phosphorylation de l’Histidine => études d’expression des gènes codant des RR de type B par …. (racines, tiges, pétioles et feuilles) soumis ou non à une contrainte osmotique. => Les facteurs de transcription seront surexprimés et introduits de manière transitoire par biolistique dans les cellules de peuplier. Leur capacité de transactivation de gènes impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique sera étudiée. Cette seconde étape permettra de démontrer que ces facteurs de transcription régulent directement des gènes de réponse des plantes à la sécheresse. En effet, une toute récente étude vient de montrer pour la première fois que l’activité trans-régulatrice de RR-18, un RR de type B de la voie de signalisation des cytokinines chez Arabidopsis thaliana nécessite son homodimérisation (Veerabagu et al., 2012). 3. Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels potentiellement impliqués dans la régulation des gènes permettant l’adaptation des peupliers à la sécheresse

Phosphorylation de l’Aspartate Données supplémentaires Phosphorylation de l’Aspartate => études d’expression des gènes codant des RR de type B par …. (racines, tiges, pétioles et feuilles) soumis ou non à une contrainte osmotique. => Les facteurs de transcription seront surexprimés et introduits de manière transitoire par biolistique dans les cellules de peuplier. Leur capacité de transactivation de gènes impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique sera étudiée. Cette seconde étape permettra de démontrer que ces facteurs de transcription régulent directement des gènes de réponse des plantes à la sécheresse. En effet, une toute récente étude vient de montrer pour la première fois que l’activité trans-régulatrice de RR-18, un RR de type B de la voie de signalisation des cytokinines chez Arabidopsis thaliana nécessite son homodimérisation (Veerabagu et al., 2012). 3. Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels potentiellement impliqués dans la régulation des gènes permettant l’adaptation des peupliers à la sécheresse

Formules d’autres acides aminés Données supplémentaires Formules d’autres acides aminés Arginine Lysine => études d’expression des gènes codant des RR de type B par …. (racines, tiges, pétioles et feuilles) soumis ou non à une contrainte osmotique. => Les facteurs de transcription seront surexprimés et introduits de manière transitoire par biolistique dans les cellules de peuplier. Leur capacité de transactivation de gènes impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique sera étudiée. Cette seconde étape permettra de démontrer que ces facteurs de transcription régulent directement des gènes de réponse des plantes à la sécheresse. En effet, une toute récente étude vient de montrer pour la première fois que l’activité trans-régulatrice de RR-18, un RR de type B de la voie de signalisation des cytokinines chez Arabidopsis thaliana nécessite son homodimérisation (Veerabagu et al., 2012). 3. Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels potentiellement impliqués dans la régulation des gènes permettant l’adaptation des peupliers à la sécheresse Sérine Thréonine

Données supplémentaires Technique du double hybride (Y2H) Mating entre levures appât et proie Levures diploïdes Interaction entre les deux protéines Activation de 2 gènes rapporteurs Sélection diploïdes Dosage β-Gal Activation HIS3 LacZ

Autre stage au LBLGC (L. Baquet M1 ) Données supplémentaires Autre stage au LBLGC (L. Baquet M1 ) Chez Arabidopsis : Récepteur osmosensing : AHK1 Récepteurs CK : AHK2, AHK3, AHK4 Protéines relais : HPt1 à HPt5 Interconnexion par HPt communes entre voie CK et voie osmosensing Chez le peuplier : Récepteurs osmosensing : HK1a, HK1b Récepteurs CK : HK2, HK3a, HK3b, HK4a, HK4b Protéines relais : HPt1 à HPt10 Quels sont les HPt communes et/ou distinctes entre la voie CK et la voie osmosensing chez le peuplier ?

Tableau récapitulatif de l’ensemble des résultats Données supplémentaires Tableau récapitulatif de l’ensemble des résultats HPt1 HPt2 HPt3 HPt4 HPt5 HPt6 HPt7 HPt8 HPt9 HPt10 HK1a +/- +++ ++ - + HK1b HK2 HK3a HK3b HK4a HK4b 4 groupes Interaction forte avec une seule HK Interaction forte avec plusieurs HK Interaction faible avec plusieurs HK Peu ou pas d’interaction avec les HK

Données supplémentaires Tableau récapitulatif de l’ensemble des résultats HPt7 partenaire préférentiel de HK1a. Partenaire spécifique de la voie osmosensing ? HPt1 et 3 partenaires préférentiels de HK3b. Partenaires spécifiques de la voie CK ? HPt2, 6, 9 partenaires communs à des HK des 2 voies. Points d’interconnexion entre les 2 voies ?

Résultats : Vue d’ensemble des 66 interactions testées Données supplémentaires Résultats : Vue d’ensemble des 66 interactions testées HK1b HK2 HK3a HK3b HK4a HK4b + pGAD- HPt2 HPt1 HPt3 HPt4 + pGAD HPt5 HPt7 HPt6 HPt8 HPt9 HPt10 pLex-HK Peu d’activation des gènes rapporteurs Intensité variable, HK3b étant le plus fort

Données supplémentaires Résultats : Détail pour HK3b + pGAD- HPt2 HPt1 HPt3 HPt4 + pGAD HPt5 HPt7 HPt6 HPt8 HPt9 HPt10 pLex-HK3b Activation des 2 gènes rapporteurs HPt 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10 Absence d’activation des gènes rapporteurs HPt 4, 7, 8

Données supplémentaires Résultats : Dosage β-Gal pour HK3b ** Les valeurs correspondent aux moyennes de 6 essais indépendants en tripliquat. ** pour p<0.01. Les barres d’erreurs standard sont affichées. Différences de force d’activation du gène LacZ HPt2 > HPt9 > HPt6 > HPt3 > HPt1