CHMI 2227F Biochimie I Enzymes: Cinétique

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Transcription de la présentation:

CHMI 2227F Biochimie I Enzymes: Cinétique CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Réactions enzymatiques Enzyme (chacun = 1 µmol) Ce sont les seules concentrations que l’on connait pcq nous préparons l’expérience. Substrat (chacun = 1 µmol) X min Produit CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on l’activité enymatique? 1. Détection du produit: pNA = para-nitroaniline  Absorbe à 405 nm H3+N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-OH O CH2 COO- CH CH3 H3C NO2 H2N pNA (jaune) H3+N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH- DEVD-pNA (incolore) DEVD Caspase 3 (protéasehydrolase) Mesure l’augmentation de A405nm CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on l’activité enymatique? 2. Accumulation/utilisation d’un cofacteur: NADH = absorbe fortement à 340 nm (e = 6.3 molL-1cm-1 ) NAD+ = n’absorbe pas à 340 nm Mesure l’augmentation de A340nm Mesure la diminution de A340nm Lactate dehydrogenase CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on l’activité enymatique? 3. Réactions enzymatiques couplées: Très utiles lorsque ni le substrat/produit/cofacteur ne peut être facilement détecté; Glutaminase + NH4+ 1ière réaction Mesure l’augmentation de A340nm Glutamate Dehydrogenase + NAD+ + NADH +H+ 2ième réaction + H2O Peut être détecté par HPLC (peu pratique) CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Réactions enzymatiques 1 min 3 µmol / min Vitesse de la réaction 15 µmol S vs 1 µmol E Temps [Produit] Pente = vitesse initiale = v0 = [P] / time 2 min 3 µmol / min 4 min <3 µmol / min CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Réactions enzymatiques 1 min 3 µmol / min 15 µmol S vs 1 µmol E 6 µmol / min 15 µmol S vs 2 µmol E 9 µmol / min 15 µmol S vs 3 µmol E Temps [Produit] v0 est proportionnel à [E] 1µmol E 2µmol E 3µmol E CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Réactions enzymatiques 1 µmol / min 1 min [Substrat] v0 Vitesse maximale = Vmax Vmax ½ Vmax 2 µmol / min 1 min 3 µmol / min 1 min E saturé par S CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Réactions enzymatiques CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Équation de Michaelis-Menten [Substrat] v0 Vitesse maximale = Vmax Vmax ½ Vmax E + S ES E + P k2 k1 k-1 RAPIDE LENT vo = Vmax [S] Km + [S] CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Équation de Michaelis-Menten [Substrat] v0 Vmax ½ Vmax Km1 Km2 E2 E1 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Km CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Turnover number E + S ES E + P RAPIDE LENT k1 k2 K-1 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Mesure de Km et Vmax Vmax ½ Vmax v0 Km [Substrate] CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Mesure de Km et Vmax 1/vo 1 = Km x 1 + 1 vo Vmax [S] 1/Vmax 1/[S] Graphe de Lineweaver-Burk 1 vo = Km x 1 + 1 Vmax [S] CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.