TD-1 Architecture du noyau et régulation de l’expression génique Le noyau contient différents compartiments comme vous avez pu le voir avec le cours précédent de CH. Ces différents compartiments sont composés de complexes protéiques. Nous allons ainsi lors de ce TD voir différentes techniques pour analyser ces complexes, que ce soit leur localisation mais aussi leur rôle… en prenant l’exemple du Polycomb. Caroline Hartmann & Sophie Filleur

Identification des protéines régulatrices du Polycomb Régulent l’expression des gènes homéotiques lors du développement Identifiées par des approches génétiques Le polycomb a été découvert en premier chez la drosophile par des approches génétiques. Protéines impliquées dans la régulation de l’expression des gènes homéotiques impliqués dans l’acquisition de l’identité cellulaire lors du développement des organismes multicellulaires. Haltere: appelées aussi balancier, servent au maintien de l’équilibre lors du vol C. Hartmann & S. Filleur Sparmann et van Lohuizen, Nature Reviews, 2006

Protéines Pc (=CBX) les premières protéines du Polycomb identifiées Domaine de liaison à la chromatine Question 1: - Quelles expériences pourriez-vous planifier pour confirmer la localisation sub-cellulaire des protéines CBX et le rôle de leur domaine de liaison à la chromatine ? Les protéines Pc (aussi appelé CBX) ont été les premières isolés comme des protéines du Polycomb. Une seule protéine est présente chez la drosophile alors que 5 membres se trouvent chez la souris. Ces protéines contiennent un domaine homologue à des domaines de liaison à la chromatine. C. Hartmann & S. Filleur

Etude de la localisation sub-cellulaire des protéines CBX 1. Immunolocalisation 2. Fusion traductionnelle avec protéine fluorescente http://www1.montpellier.inra.fr/ibip/bpmp/ateliers/microscopie/immunocytochimie.htm CBX4 dans cellule Hela Pirrotta et Li, Cur. Op. Genet. Dev., 2012 Analyse de la localisation nucléaire des protéines Pc : Ces protéines non réparties de manière homogène dans le noyau mais se situent dans ce qui a été appelé ‘Polycomb bodies’. Rouge = Hoechst t Gène d’intérêt Gène codant une protéine fluorescente (GFP) Promoteur du gène d’intérêt ou constitutif CBX2 dans cellule de fibroblaste d’embryon de souris C. Hartmann & S. Filleur Vincenz et Kerppola, PNAS, 2008

Etude de la liaison des protéines CBX à la chromatine Extraction de la chrI Fixation des protéines sur l’ADN Bioinfo-fr.net; Lee et al, Nature Protocols, 2013 C. Hartmann & S. Filleur

Etude de la liaison des protéines CBX à la chromatine Analyse de la liaison de CBX-7 avec la chromatine au cours de la différentiation de cellule embryonnaire de souris La liaison de CBX7 à la chromatine chez la souris ne se fait qu’après 6 jours de différentiation donc la liaison des protéines CBX à la chromatine dépend du stade de différenciation. Bernstein et al, Mol. Cel. Biol., 2006 Question 2: - Que pouvez-vous conclure de ce résultat? Bioinfo-fr.net; Lee et al, Nature Protocols, 2013 C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines régulatrices du polycomb forment entre elles des complexes multi-protéiques? Question 3: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? Plusieurs protéines ont été isolées par des approches génétiques comme intervenant dans la régulation de l’expression des gènes homéotiques. Vu le nombre les chercheurs se sont demandés si certaines protéines ne faisaient pas partie de complexes protéiques. C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines régulatrices du polycomb forment entre elles des complexes multi-protéiques? Question 3: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? - In silico C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines régulatrices du polycomb forment entre elles des complexes multi-protéiques? Question 3: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? - In silico - In vitro C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines régulatrices du polycomb forment entre elles des complexes multi-protéiques? Question 3: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? - In silico - In vitro Co-immunoprécipitation C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines régulatrices du polycomb forment entre elles des complexes multi-protéiques? Question 3: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? - In silico - In vitro Co-immunoprécipitation Lee et al, Nature Protocols, 2013 C. Hartmann & S. Filleur Ab anti-prey prot.

Est-ce que les protéines régulatrices du polycomb forment entre elles des complexes multi-protéiques? Question 3: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? - In silico - In vitro Co-immunoprécipitation Input= Western classique avec anti-Ring1 Mock IP= utilisation d’un serum pre-immun pour l’IP. hPC2: utilisation d’un ac anti-PC2 (=CBX4) pour l’IP BMI1: utilisation d’un ac anti-BMI1 (=autre protéine connue du polycomb) pour l’IP hPc2=CBX4 C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines régulatrices du polycomb forment entre elles des complexes multi-protéiques? Question 3: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? - In silico - In vitro Co-immunoprécipitation Far-western TAP-tag (Tandem Affinity Purification) Far-western et TAP-tag ainsi que les approches in vivo seront revus dans l’UE adopte un gène! C. Hartmann & S. Filleur

C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines régulatrices du polycomb forment entre elles des complexes multi-protéiques? Question 3: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? - In silico - In vitro Co-immunoprécipitation Far-western TAP-tag (Tandem Affinity Purification) -In vivo C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines régulatrices du polycomb forment entre elles des complexes multi-protéiques? Question 3: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? - In silico - In vitro Co-immunoprécipitation Far-western TAP-tag (Tandem Affinity Purification) -In vivo Double-hybride en levure FRET BiFC FRET estime la distance entre les deux protéine BiFC : estime l’interaction C. Hartmann & S. Filleur

Les complexes PRC (Polycomb Repressive Complex) chez les mammifères Il a été montré par ces approches que deux complexes protéiques majoritaires constituent le polycomb (en fait il semblerait qu’il en existe 4 mais cela dépend des organismes?). Chaque complexe est composé d’un cœur de protéines impliqué dans l’activité de chaque complexe. C. Hartmann & S. Filleur Aranda et al, Science Adv., 2015

Les complexes PRC (Polycomb Repressive Complex) chez les mammifères Mais de nombreuses protéines sont impliqués dans l’activité de ces PRCs. Pour essayer de voir comment analyser le rôle de chaque protéine des PRCs, on va reprendre l’exemple des protéines CBX. C. Hartmann & S. Filleur Aranda et al, Science Adv., 2015

PRC (Polycomb Repressive Complex) et leur activité modifiant les histones du nucléosome RING1A et RING1B= ubiquitin E3 ligases H2A histone; K119ub1 = Ubiquitination de la lysine 119 Complexe à activité méthyl-transférase H3 histone; K27me3 = 3 groupes méthyl sur lysine 27 Adapté de Blackledge et al, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2015 C. Hartmann & S. Filleur

Rôle des protéines CBX du PRC1 leur activité modifiant les histones du nucléosome Domaine de liaison aux histones méthylés? Les CBX ont un domaine en C-ter homologue à des domaines protéiques impliqués dans la méthylation des histones, ce qui laisse supposer un rôle des CBXs dans les changements des histones du nucléasome. Comme au niveau du polycomb, seul l’histone 3 semble être méthylée par le polycomb, nous allons étudier par la suite l’effet des CBX sur H3K27me3. C. Hartmann & S. Filleur

Les protéines CBX du complexe PRC1 sont-elles capables d’interagir avec les histones méthylées H3 du nucléosome? Expérience de Co-IP: Protéine appât= Flag-CBX7 Protéine proie= H3K4me3 (marque des gènes transcrits activement)ou H3K27me3 Input=western blot Bernstein et al, Mol. Cel. Biol., 2006 Question 5: - Quelles conclusions pouvez-vous tirer de ces résultats? CBX7 interagit spécifiquement avec H3K27me3. cela a été montré de manière similaire pour les autres CBX de la souris. C. Hartmann & S. Filleur