CPPK département - Université Paris 5 Inserm Institut national de la santé et de la recherche médicale  Le point sur les transporteurs et leur impact dans le développement cinétique du médicament J.M.SCHERRMANN INSERM U26 et CPPK département - Université Paris 5

"Drug transport in the intestine occurs mainly by diffusion".... TRANSPORTEURS ET PHARMACOCINETIQUE ETAT DES CONNAISSANCES EN 1987 Michael SCHWENK : Review, Drug Transport in intestine liver and kidney. Arch. Toxicol. 60, 37, 1987 "Drug transport in the intestine occurs mainly by diffusion".... " Intestinal drugs carriers contribution seems to be of minor importance." "The liver is the organ where carrier-mediated drug transport predominates" Rôle des mécanismes de transport en ADME et stratégies d’étude en phase préclinique, GMP, 13-14 octobre 1998, Paris

Four hypothetical carrier systems for hepatocellular drug uptake TRANSPORTEURS ET PHARMACOCINETIQUE ETAT DES CONNAISSANCES EN 1987 Michael SCHWENK : Review, Drug Transport in intestine liver and kidney. Arch. Toxicol. 60, 37, 1987 Four hypothetical carrier systems for hepatocellular drug uptake Carrier 1 Carrier 2 Carrier3 Carrier4 "bile acid carrier" "organic anions" "organic cations" Bile acids Estronesulfate Estradiol glucuronide Bilirubin Bromosulphophtalein ANS Indocyanine green Morphine Nalorphine Ouabain Rôle des mécanismes de transport en ADME et stratégies d’étude en phase préclinique, GMP, 13-14 octobre 1998, Paris

TRANSPORTEURS ET ADME EN 1996 A. TSUJI, Carrier-mediated Intestinal Transport of Drugs, Pharm. Res., 1996 PepT1 MCT1 MDR1 Absorption et sécrétion intestinales

TRANSPORTEURS RENAUX EN 1997 K.j. ULLRICH, Renal transporters for organic anions and organic cations, J. Membrane Biol, 1997 OCT1 MDR1 MRP Oatp1 Sécrétion et réabsorption rénales

TRANSPORTEURS HEPATIQUES EN 1997 D. K. MEIJER, Adv. Drug Deliv. Rev., 1997 Métabolisme et excrétion biliaire

Le transport en 2004 ?

Vers l’identification et la cartographie cellulaire des protéines de transport impliquées dans ADME Vers la vectorisation des processus cinétiques de ADME et de nombreuses questions sur leur rôle fonctionnel et leur impact sur les stratégies de développement du médicament

ENZYMES/TRANSPORTEURS : SIMILITUDES Protéines Expression ubiquitaire Inhibition (domaine des Km, Ki du nM au mM) Polymorphismes Génétiques Induction (voies de transcription communes : PXR, CAR, FXR…) (CYP 3A –ABCB1 (P-gp)) Polyspécificité des substrats transformés ou transportés

Polymorphisme génétique de la P-gp Exon 26 C 3435 T  mutation silencieuse  C 3435 T 

CD-TT > CD-CC AUC TT > AUC CC 38% Polymorphisme génétique de la P-gp : effets sur l’absorption intestinale de la digoxine CD-TT > CD-CC AUC TT > AUC CC 38% En relation avec  niveau expression P-gp des entérocytes (barrière intestinale) TT : faible niveau d’expression CC : fort niveau d’expression Extrait de Hoffmeyer et al., 2000

Polyspécificité des substrats transportés Cations organiques amphiphatiques ABCB1, ABCC1, ABCG2 Substrats communs entre ABC protéines ABCB1 ABCC1 vbl col dox pra ABCG2 From LITMAN et al. CMLS 2001

Le tandem cinétique enzyme - transporteur Déterminisme ou Stochastisme ? CYPs UGTs T M T M M-OH M-OC M-OC Phase 0 Phase 1 Phase 2 Phase 3 ex : couplage CY3A / P-gp au niveau intestinal régulation coordonnée des gènes ?

ENZYMES/TRANSPORTEURS : DIFFERENCES fonction biotransformation chimique transport expression cellulaire organites intracellulaires membranes plasmique, mitochondriale, nucléaire co-facteurs de la réaction NADPH, Fe,… ATP, GSH, H+,

Application du concept dans les modèles in vitro Polarisation de l’expression des transporteurs sur les cellules épithéliales et endothéliales Pôle apical MDR 3 MDR1 P-gp MDR3 P-gp MRP1 cMOAT (MRP2) Pôle basal Application du concept dans les modèles in vitro

2004 – UNE TRENTAINE DE TRANSPORTEURS D’INTERET EN ADME INTESTIN FOIE PROTEINES ABC (7) OATs (4) OATPs (9) Pep T 1/2 MCT 1/2 BARRIERES : BHE, placenta, prostate REIN OCTs (5) ENTs (8) BEAUCOUP D’AUTRES IMPLIQUES EN PK-PD ex : bioamines cérébrales (sérotonine, dopamine……) polymorphisme génétique du transporteur 5 HTT

La super famille des protéines ABC 49 transporteurs ATP – Binding Cassette chez l’Homme Noms ABC1 MDR P-gp MRP ALD OABP GCN20 White BCRP Sous-familles ABCA ABCB ABCC ABCD ABCE ABCF ABCG Membres 12 11 13 4 1 3 5 (+1?) Transport actif primaire uniport théorie « flippase », « vacuum cleaner »(P-gp) co-transport avec GSH (MRPs)

MRPs : ABCCs MRP1: 190kDa. 930 (MRP9) à 1545 aa (MRP2). NH2 MRP1: 190kDa. 930 (MRP9) à 1545 aa (MRP2). Transporteurs ABC Dépendent du GSH (co-transport) MRP1 extra intra ATP ATP extra MRP5 Substrats : composés anioniques, conjugués au glutathion, aux sulfates et à l’acide D-glucuronique. Ex: leucotriène C4, oestradiol-17--D-glucuronide. NH2 intra MRP9 ATP ATP Intracellulaire D’après Borst et al.(2000) et Bera et al.(2002) Inhibiteurs : Probénécide, indométacine, MK571

La super famille des protéines SLC Transporteurs d’anions organiques polypeptides : OATPs/oatps (SLC21A) - superfamille « membrane solute carrier », famille SLC21A/slc21a - transport actif secondaire (GSH, anions inorganiques) - rat /souris / homme : 11/8/9 représentants caractérisés - 643 à 722 aa., 12 TDMs N-glyc Signature de la famille Substrats : anions organiques de PM >450Da. ex: sels biliaires, DHEA, digoxine, taurocholate, agonistes des récepteurs opioïdes  (DPDPE)… Inhibiteurs : digoxine, PSC833, probénécide.

La super famille des protéines SLC Transporteurs d’anions organiques : OATs(SLC22A) - Transport actif secondaire - 4 représentants caractérisés (OAT1 à OAT4) - Distribution tissulaire : rein et foie - Cerveau : BHE : OAT3 sur la membrane luminale des cellules endothéliales BHL : OAT1 et OAT3 sur la membrane apicale des cellules épithéliales des PC D’après sweet et al., 2001 - Substrats : acide p-aminohippurique, céphalosporines, AINS, fluorescéine, pesticides, herbicides. - Inhibiteur : probénécide

La super famille des protéines SLC Transporteurs des cations organiques : OCTs (SLC22A) transport actif secondaire potentiel dépendant : OCT1, OCT2, OCT3, +H dépendant : OCTN1, OCTN2 distribution : rein et foie intestin, cœur, cerveau, placenta substrats : amines endogènes (acétylcholine, choline, dopamine, épinéphrine…) cimétidine, morphine, vérapamil, quinine, quinidine, paraquat D’après Koepsell, 1998

Vers le savoir…

Claire Mercier, Doctorat de l’Université Paris5, 9 décembre 2003 Expression dans des organes pluricellulaires exemple : cerveau et protéines ABC Claire Mercier, Doctorat de l’Université Paris5, 9 décembre 2003 Expression et régulation de quatre transporteurs ABC impliqués dans les mécanismes de multirésistance médicamenteuse, P-gp, Mrp1, Mrp5 et Mxr, chez les rongeurs: le modèle astrocytaire. La MRP1 ou l’ABCC1 NBD1 NBD2 TMD0 TMD1 TMD2

Expression de la Mrp1 sur les barrières cérébrales chez le rat adulte Expression dans des organes pluricellulaires exemple : cerveau et protéines ABC C. Mercier et al, Brain Res. (soumis) Expression de la Mrp1 sur les barrières cérébrales chez le rat adulte Ependyme, Astrocytes ss ép. Méninges Glie limitante Plexus choroïdes Ependyme Cap M CP Ep V F1  BHE Mrp1 GFAP

Expression dans des organes pluricellulaires exemple : cerveau et protéines ABC BHE Plexus choroïdes Ventricule Méninges Neurone Astrocyte Ependyme Parenchyme cérébral Mrp1 P-gp Mrp5 Abcg2

Induction des protéines de transport exemple : barrière hémato-encéphalique et protéines ABC JONCTION SERREE PERICYTE ASTROCYTE NEURONE CELLULE ENDOTHELIALE Membrane basale SANG Pgp Mrp1

Induction des protéines de transport exemple : barrière hémato-encéphalique et protéines ABC Effets de la puromycine sur l’expression de mdr1b dans les cellules endothéliales RBE4 P. Demeuse, J. Neurochem., 2004 Effet de la doxorubicine sur l’expression de mdr1b chez l’astrocyte de rat C. Mercier, J. Neurochem., 2003 50 500 GPNT contrôle 4 h 12 h 24 h 48 h A GAPDH ARNm mdr1b B 500 50 + 72 h w P-gp HL60 contrôle 4 h 12 h 24 h 48 h PUR et DOX provoquent : transcription du gène mdr1b de manière dose- et temps-dépendante

Régulation de l’expression de la P-gp dans les astrocytes de rat C. Mercier, J. Neurochem., 2003 Activité fonctionnelle, 24 h d’exposition à la vincristine contrôle 50 ng/mL 500 ng/mL PSC833 ** *** P-gp fonctionnelle et inhibée par PSC833. Corrélation entre l’expression des ARNm, de la protéine et de la fonctionnalité.

Fanchon Bourasset, Doctorat de l’Université Paris5, 17 décembre 2003 Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par le M6G Fanchon Bourasset, Doctorat de l’Université Paris5, 17 décembre 2003 Implication des transporteurs d’influx et d’efflux dans la neuropharmacocinétique des xénobiotiques La P-gp ou l’ABCB1 cavéoline

Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par le M6G Problématique : pourquoi l’activité analgésique du morphine-6 glucuronide (M6G) est supérieure à celle de la morphine alors que sa perméabilité membranaire est dix fois plus faible ? Données bibliographiques : Inhibition du passage de la BHE par le PSC 833 et le vérapamil (BBB in vitro, Huwyler, 96, 98; in vivo, Lötsch, 02) Effet analgésique identique entre mdr 1a (-/-) et mdr 1a (+/+) pour le M6G (Lötsch, 00) mais différent pour la morphine (Thompson, 00)

Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par le M6G Hypothèses testées par la méthode de perfusion cérébrale in situ Rôle de la P-gp dans le passage de la BHE du M6G : souris sauvages / déficientes en P-gp (mdr1a (-/-)), +/- digoxine, PSC833 Rôle de transporteurs d’anions organiques - Mrp1 (souris sauvages / mrp1 (-/-)) - oatps, souris sauvages +/- digoxine, PSC833 Rôle de GLUT-1

Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par le M6G Kin expérimental Kin prédit 1000 imipramine 100 S18986 diazépam 10 1 D-glc TXD258 morphine vinblastine 0,1 Kin(µl/g/s) M6G vincristine 0,01 0,001 0,0001 sucrose 0,00001 0,000001 0,0001 0,01 1 100 10000 1/2 P/MM

GLUT 1 LAT 1 A, B0+ ASC OATP A oatp 2 MCT1 OAT ? P-gp OCT? SANG Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par le M6G Na+ GLUT 1 LAT 1 A, B0+ ASC NUTRIMENTS ANIONS ORGANIQUES OATP A oatp 2 MCT1 OAT ? CATIONS ORGANIQUES membrane abluminale membrane luminale P-gp ATP OCT? SANG CERVEAU

F. Bourasset et al, J. Neurochem, 2003 Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par le M6G F. Bourasset et al, J. Neurochem, 2003 P-gp non impliquée Mrp1 non impliquée Transport du M6G à travers la BHE par: GLUT-1 Transporteur sensible à la digoxine et PSC833 : oatp2?

X SANG P-gp OATP A oatp 2 GLUT 1 CERVEAU Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par le M6G SANG P-gp OATP A oatp 2 GLUT 1 ATP membrane luminale X membrane abluminale CERVEAU

PSC 833 SANG P-gp OATP A oatp 2 CERVEAU Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par la digoxine et les enképhalines (DPDPE) PSC 833 SANG P-gp OATP A oatp 2 ATP membrane luminale membrane abluminale CERVEAU

Corrélation inter-modèles (in vitro, in situ, in vivo) Salvatore Cisternino, Doctorat de l’Université Paris5, 19 décembre 2003 Etudes fonctionnelles de protéines ABC ( P-glycoprotéine, Mrp1, Bcrp) au niveau de la barrière hémato-encéphalique chez les rongeurs La MXR ou l’ABCG2 TMD NBD OUT IN GMP 2004

La perfusion cérébrale in situ Saccharose* + molécule étudiée * Tampon physiologique Isole le cerveau /organisme Parfait contrôle du milieu de perfusion Sensible Simple Possibilité de vérification de l’intégrité de la BHE Applications: Rat (Takasato et coll., 1984) Souris (Dagenais et coll., 2000) 1 On 2 Off GMP 2004

(S. Cisternino et al, Pharm. Res., 2003) Mesure du transport cérébral en trans-influx zéro : Souris Mrp1(-/-) vs. Souris sauvages (S. Cisternino et al, Pharm. Res., 2003) mrp1(+/+) mrp1(-/-) Pas d’effet de la Mrp1 sur le transport cérébral de ces molécules (idem 99mTc-Sestamibi; Cattelotte et coll.,2004) GMP 2004

Influence de l’Abcg2 sur le transport cérébral au niveau de la BHE chez la souris ATP ? (BCRP) ABCG2 Eisenblatter et coll., 2002; 2003 Cooray et coll., 2002 Zhang et coll., 2003 ESPACE VASCULAIRE ABCB1 ABCC1 (P-gp) (MRP 1) ATP ATP Membraneluminale X Membrane abluminale PARENCHYME CEREBRAL

La BCRP (ABCG2 ou MXR) Structure: 72 Kda (monomère) protéine ABC sous famille G 6 segments, 1 TMD, 1 NBD Homodimérisation Phénotype MDR Substrats: Mitoxantrone, prazosine, SN38, 3TC Modulateurs: GF120918, Fumitrémorgine C Localisation: Physiologique et tumorale rein, intestin, placenta, BHE Subcellulaire: Apicale co-localisation avec la P-gp (polarisé) BHE In vitro : cellules endothéliales de porc, homme In vivo : pas de données Étude menée in vivo pour déterminer l’influence de l’Abcg2 sur le transport cérébral

Mesure du transport cérébral: Substrat mixte P-gp/Bcrp: Methodologie : Perfusion cérébrale in situ chez la souris Mesure du transport cérébral: Substrat mixte P-gp/Bcrp: [3H]-Mitoxantrone (MX) [3H]-Prazosine Non substrat de la Bcrp: [3H]-Vinblastine Souris : Sauvage & Mdr1a(-/-) Composés : [3H]Mitoxantrone [3H]Prazosine [3H]Vinblastine [14C]Sucrose GF120918 PSC833 Influence de la P-gp : comparaison sauvage / Mdr1a(-/-) -PSC833 (modulateur de la P-gp) Influence de la Bcrp : - GF120918 (modulateur mixte Bcrp/P-gp)

Méthodologie : Etude de biologie moléculaire Déplétion Capillaire (Triguero et coll., 1990): Perfusion cérébrale in situ avec un tampon (rincer le cerveau du sang) Déplétion – homogénéisation mécanique–centrifugation Culot (capillaires cérébraux) souris sauvage / mdr1a(-/-) RT-PCR quantitative en temps réel (cortex; capillaire cérébral) : abcg2 ARNm gapdh ARNm (référence) Spécificité (gel d’agarose, courbe de dissociation)

Étude du transport cérébral de la [3H]-prazosine chez la souris 1 2 3 4 [ H]-Prazosine K in (µl s -1 g ) †† souris sauvage souris mdr1a(-/-) *** Prazosine (30 µM) *** ** PSC833 (3 µM) Témoins GF120918 (2 µM) Pas d’effet de la P-gp sur le transport cérébral de prazosine Efflux indépendant de la P-gp (GF120918, prazosine), surexpression ?

Étude du transport cérébral de la [3H]-mitoxantrone chez la souris †† 1 2 3 4 5 6 [H ]-Mitoxantrone K in (µl s -1 g ) Souris sauvage Souris mdr1a(-/-) *** *** †† Témoins PSC833 (3 µM) GF120918 (2 µM) MX 100 µM Pas d’effet de la P-gp sur le transport cérébral de MX Efflux indépendant de la P-gp (GF120918), surexpression ?

Enrichissement d’abcg2 au niveau des capillaires cérébraux Transcrits d’abcg2 dans le cortex et les capillaires du cerveau de souris par Q-RT-PCR abcg2 ARNm gapdh sauvage mdr1a ( - / - ) Cortex cérébral 1.0 ± 0.2 ND Fractions de Capillaires cérébraux 680 ± 50 2200 ± 200 Enrichissement d’abcg2 au niveau des capillaires cérébraux Compensation de mdr1a par l’abcg2

Conclusions GF120918 inhibe un transporteur d’efflux autre que la P-gp et impliqué dans le transport de la MX et de la PRA 2) Inhibition par le GF120918 est plus forte pour les souris mdr1a(-/-) que pour les souris sauvages pour le transport de MX et de PRA 3) Ce transport n’est pas sensible au PSC833 (pas d’effet sur la Bcrp) 4) RT-PCR confirme la présence et l’enrichissement des transcrits d’ abcg2 au niveau du capillaire cérébral 5) Abcg2 est surexprimée au niveau des capillaires de souris mutantes mdr1a(-/-)

Synergie entre ABC protéines et physiopathologies Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis (PFIC type 3) PFIC Type 2 (MDR 1, PGP) B 1 (MRP 2) C2 DUBIN-JOHNSON SYNDROME G5/G8 Bilirubine Conjugates and Drugs B 11 ( BSEP) B 3 (MDR 3) Phospholipids SITOSTEROLEMIA PMG and MDR Bile salts Cholesterol Micelles Canalicule biliaire

Corrélation inter-modèles (in vitro, in situ, in vivo) Quel modèle d’étude du transport ? A quel stade du développement ? Quelle réponse? modèles stade de développement réponses Systèmes transfectés précoce (HTS) substrat O/N inhibiteur O/N, a Monocouches cellulaires précoce ( ± HTS) polarisation du transport, a Tissus, organes isolés In situ candidat sélectionné impact sur A/M ou D/M ou E/M, a Animal entier Impact sur ADME a) Possibilité de déterminer les paramètres cinétiques (Vmax, KT…)

Synergie entre modèles vitro-vivo Pharmacocinétique des systèmes intégrés et physiopathologiques Pharmacocinétique moléculaire et cellulaire Vers le futur …

Remerciements C. Mercier, F. Bourasset, S. Cisternino, E. Niel