Epidermolyses bulleuses: physiopathologie génotype/phénotype Diagnostic anténatal Structure/fonction réversion phénotypique thérapie génique ABERDAM Daniel INSERM U634 aberdam@unice.fr

BP280 Collagène VII Cytokératines Plectine kératinocyte

BP280 Collagène VII Cytokératines Plectine kératinocyte Hémidesmosomes

Anticorps monoclonal GB3 Immunisation de souris par des antigènes Collecte du sérum (lymphocytes B) Fusion des lymphocytes B avec une lignée lymphoma: hybridome Sélection clonale d’un hybridome

EPIDERMOLYSIS BULLOSA (EB) Epidermolyse Bulleuse Simplex Epidermolyse Bulleuse Jonctionnelle Epidermolyse Bulleuse Dystrophique Cytokeratines Peau EB EBS (R) Plectine BP280 Epiderme EBJ (R) Derme EBD (D et R) Collagène VII

Anticorps monoclonal GB3

Anticorps monoclonal GB3 Cytokeratines K5/K14 EBS Plectine BP280 Intégrine 64 EBJ EBD Collagène VII

Epidermolyse bulleuse jonctionnelle(EBJ) * * * contrôle EBJ

Cellules du patient ADN génomique ARNm Protéines Southern blot PCR Banque génomique ChIP Northern blot RT-PCR Banque d’ADNc Banque d’expression Western blot IP Anticorps

Molécule trimérique, sécrétée dans la MEC Protéine sécrétée IF IP

Criblage de banque d’expression Colonne d’affinité GB3 Anticorps polyclonaux Criblage de banque d’expression Clonage et séquençage Sequençage de peptides Oligonucléotides dégénérés RT-PCR et clonage

kératinocyte Laminine-5    1q25-q31 18p11.3 1q32 Cytokératines NH2 Laminine-5 2 -    1q25-q31 18p11.3 1q32 Cytokératines Plectine BP280 Intégrine 64 Collagène XVII (BP180) Laminine-5 Collagène VII

Immunofluorescence sur biopsies cutanées 3 3 2 Contrôle Patient

Liaison génétique entre le gène LAMC2 et l’EBJ-H Difficultés: trois gènes. caractère récessif et léthal 3 familles consanguines Recherche de microsatellites CA/GT proches (ou dans le locus LAMC2) 3 marqueurs AFM + un microsatellite lié à LAMC2 (variabilité de 13 allèles # dans la population caucasienne) CACA….CACA

gène ADNc 5’ 3’ C P Hétéroduplex Homoduplex

Famille consanguine. Patient homozygote contrôle Mutant T C G A T C G A 3 ’ A A Stop Arg G G C T 5 ’ 3 3 2 Northern blot N M N M N M Exon 3

Allele-Specific Oligonucleotide (ASO) Example d’une famille non consanguine Mutation portée par la mère Mutation portée par le père

Formes non léthales d’EBJ Expression réduite de laminine-5 mutée Etat traumatique, sans soins efficaces

culture in vitro de kératinocytes THERAPIE GENIQUE CUTANEE Ex vivo Diagnostic génotypage biopsie cutanée culture in vitro de kératinocytes transduction rétrovirale greffe feuillets épithéliaux

Thérapie génique des EB Phénotype/génotype: - diagnostic (immunohistologie, moléculaire) - recherche de mutation Transfert de gène: - primo culture - choix du vecteur (lentivirus, intégrases,…) - réversion phénotypique Transplantation: - modèles animaux - prise de greffe - évaluation de la réponse immunitaire - expression du transgène in vivo sur du long terme - évaluation des risques de mutation insertionnelle du transgène

PRODUCTION D ’UN VIRUS « CURATIF » Laminine 5 Vecteur viral Production de particules virales Culture in vitro de kératinocytes EB

R é version ph é notypique de k é ratinocytes EBJ EBJ EBJ - R WT EBJ Cha î ne ß 3 - mutations R42X / E210K EBJ EBJ - R WT EBJ EBJ -R

MC DC EBJ reverted Vinculine detached cells (%) minutes 10 20 30 MC reverted 100 80 60 40 DC EBJ EBJ detached cells (%) 20 40 60 80 100 5 10 15 minutes wt reverté K EBJ Vinculine EBJ-R

Applications potentielles de la thérapie génique cutanée correction de défauts géniques catabolisme de toxines circulantes sécretion de médicaments diffusibles

Promoteur K5-leptin-LacZ Correction du phénotype d’obésité par transplantation d’une peau transgénique Larcher et al.(2001) . FASEB J 15: 1529-38 Day 9 Day 32 Promoteur K5-leptin-LacZ 1 Souris ob/ob 2 Greffe d’épiderme human exprimant la leptine 0,5 1 1,5 2,5 5 10 15 days serum leptin (ng/ml) Leptin HK control