Cours de toxicologie UNIVERSITE Dr Tahar Moulay- Saida Faculté des Sciences Département de Biologie Cours de toxicologie Pr.SLIMANI.M Pr SLIMANI.M

Domaine de la toxicologie : La toxicologie est la science qui étudie les risques et les effets liés à l’exposition à un toxique (environnementale ou professionnelle) . Domaine de la toxicologie : - Toxicologie clinique ; Toxicologie fondamentale ; Toxicologie professionnelle (Industrie, Agriculture) ; Hygiène alimentaire (additifs et résidus) ; Hygiène sociale (toxicomanie); Eco toxicologie: toxicologie environnementale ; Toxicologie réglementaire : définir les valeurs références d’emploi de substances éventuellement toxiques , pour protéger la santé humaine ou celle des écosystèmes ; Bio toxicologie (toxicologie expérimentale, descriptive et clinique). - La toxicité est la capacité intrinsèque d’un agent chimique à avoir un effet nocif sur un organisme. -Le terme xénobiotique désigne une «substance étrangère», à l’organisme, par opposition aux composants endogènes. Les xénobiotique comprennent les médicaments, les produits chimiques industriels, les poisons naturels et les polluants environnementaux. Pr SLIMANI.M

PRINCIPAUX TYPES D'INTOXICATIONS -Intoxications aigue ( short term): Elle résulte de l'administration d'une dose unique ou de fractions de doses réparties sur 24 h. Elle entraîne la mort ou une anomalie particulière : -Toxicité digestive : nausées, vomissements, diarrhées, douleurs abdominales, coliques -les troubles nerveux, une altération de la formule sanguine. -Intoxications sub aigues : Elle résulte de l'administration d'une substance pendant une période allant de14 jours à 3 mois (expositions répétées pendant un temps limité). Intoxications chronique : Résulte de l’absorption répétée, pendant un temps suffisamment long (+ 90 jours – 18 mois) de faibles doses de toxique. Il s’agit d’une toxicité qui apparaît par cumul du toxique dans l’organisme appelée « toxicité cumulative » Exemple :L'inhalation d'amiante peut provoquer une fibrose pulmonaire après un délai de nombreuses années sans exposition Pr SLIMANI.M

Les différents effets toxiques : On classe généralement les effets toxiques : -L’effet local correspond à une action immédiate du produit au niveau de la zone de contact : tube digestif, peau, appareil respiratoire, irritants (inflammation locale réversible) . L’effet systémique résulte de l’action du toxique après absorption et distribution dans différentes parties de l’organisme humain (foie, reins, système nerveux, système digestif, os, etc Les effets spécifiques : cancérigène, mutagène, reprotoxique. Le meilleur test de validité d'effet est l'établissement d'une relation quantitative entre un effet et la dose administrée la dose est exprimée en poids pour une absorption digestive , -en concentration par g/surface pour une application cutanée, -en concentration /litre d'air ( ou m3) en cas d'inhalation Pr SLIMANI.M

Les phases du processus d'intoxication La phase d'exposition : mise en contact avec le toxique suivie de sa résorption La phase toxico cinétique : elle commence après la résorption et aboutit à la présence du toxique dans le milieu intérieur . La nature et l'intensité des effets d'un xénobiotique sur un organisme sont en relation avec la concentration du produit actif au niveau des organes cibles. Celle- ci dépend de la dose introduite et de facteurs tels que l'absorption ,la distribution ,le métabolisme et l'excrétion (ADME). La fraction de substance qui passe de la phase d'exposition à la phase toxico cinétique détermine sa disponibilité chimique - La phase toxico dynamique (interaction avec le tissu cible) La fraction de substance qui passe de la phase toxico cinétique à la phase toxico dynamique détermine la disponibilité biologique ou bio disponibilité. C'est à l'issue de la phase toxico dynamique que l'on peut observer les effets toxiques d'une substance. Pr SLIMANI.M

flux net = Kp.S.(C2-C1) Kp: coefficient de perméabilité membranaire RESORPTION DES TOXIQUES Diffusion passive La plupart des toxiques sont absorbés par diffusion passive: la diffusion s’effectue suivant le gradient de concentration jusqu’à équilibre de part et d’autre de la membrane si le phénomène est statique. Les membranes biologiques étant lipophiles, plus le degré de lipophilie du toxique est important, mieux il traverse les membranes. Le temps nécessaire pour qu'un équilibre entre un organisme et le milieu extérieur soit atteint dépend: - De sa lipophilie - De sa concentration - De la surface d'échanges (digestive - respiratoire - cutanée) C'est par ce type de diffusion passive que l'accumulation de toxiques flux net = Kp.S.(C2-C1) Kp: coefficient de perméabilité membranaire loi de Fick Avec Kp = Kdif x Kow / d ; Kdif : coefficient de diffusion ; Kow : coefficient de partition octanol/ eau ; d : épaisseur de la membrane considérée . seules les petites molécules non chargées et peu polaires passent facilement à travers les membranes. Pr SLIMANI.M

-Filtration : Le flux de l'eau au travers des pores membranaires peut produire le passage de toxiques. Les pores de la plupart des cellules ont un diamètre d'environ 4 mm: seuls les toxiques hydrosolubles de masse molaire faible (100-200) peuvent les traverser. -Transport actif : Il implique l'intervention d'un transporteur macromoléculaire situé d'un coté de la membrane. Le complexe ainsi formé diffuse de l'autre coté ou la substance ainsi transportée est libérée. Le transporteur reprend ensuite sa position initiale et le cycle peut recommencer. Le transport s'effectue contre un gradient de concentration. Il est spécifique pour un toxique ou un groupe de toxiques chimiquement apparentés, d’où la possibilité d'observer des phénomènes d'inhibition compétitive. -saturable, dépendant d’énergie , peut être inhibé par certains toxiques interférant avec le métabolisme cellulaire. Pr SLIMANI.M

Absorption : différentes voies de pénétration sont possibles La voie cutanée : La voie cutanée soit par absorption (voie percutanée) soit lésion (voie transcutanée). La première barrière rencontrée par le toxique est l'épiderme et surtout la couche cornée . L'absorption cutanée est fonction des propriétés physico-chimiques des produits, de petites quantités de substances polaires peuvent la traverser ;les substances non polaires y diffusent grâce à leur liposolublé . Le derme, barrière moins sélective ,est plus facilement franchissable .Dans certains cas ,la résorption de toxiques le tétrachlorure de carbone, des insecticides est suffisantes pour entraîner des effets systémiques .Les effets peuvent être locaux (allergie, nécrose) ou général. -Voie oculaire : elle concerne surtout les projections dans l'œil ou la survenue d'un phénomène irritatif dû a l'action d'un toxique au niveau de la muqueuse oculaire. La phase toxico cinétique (A.D.M.E) Pr SLIMANI.M

Différentes voies de pénétration des toxiques dans l’organisme Voie pulmonaire (inhalation) Xénobiotique poumons Voie cutanée Voie Orale Veine pulmonaire cerveau Artère pulmonaire distribution Veine sus hépatique Veine cave inférieur Tube digestif Veine porte foie Ventricule gauche Ventricule droit Voies biliaires Artère carotides Canal cholédoque bile Aorte Artère vertébrales Artère rénal Artère hépatique fèces Autres organes rein Urines Différentes voies de pénétration des toxiques dans l’organisme Pr SLIMANI.M

Voie pulmonaire :- La voie pulmonaire par inhalation de substances gazeuses ou de particules volatiles. On distingue trois niveaux pour les voies respiratoires : la région extra thoracique (cavités nasales, pharynx et larynx), la région thoracique (trachée, bronches et bronchioles) et la région alvéolaire (bronchioles terminales, sacs alvéolaires et alvéoles). Les poumons ont une surface alvéolaire importante, un débit sanguin élevée et les échanges entre l'air alvéolaire et le sang sont intenses. Cette voie est impliquée pour l'entrée des toxiques . L'absorption des particules dépend de leur taille. Les plus grossesse déposent sur la muqueuse nasale, elles sont éliminées avec les sécrétions nasales ou absorbées au niveau du tractus gastro intestinal. Les particules de taille moyenne peuvent se déposer dans la trachée ,les bronches ou les bronchioles, puis éliminées par la toux ou re ingérées. Les petites particules peuvent diffuser à travers l'épithélium pulmonaire et passer dans le sang ,d'autant plus facilement qu'elles sont hydrosolubles et de masse molaire inférieurs à 10 000. Pr SLIMANI.M

Niveau de pénétration des particules dans les différents étages de l’arbre respiratoire Pr SLIMANI.M

Exemple :Elle permet l'absorption des gaz ( mono-oxyde de carbone, oxyde d'azote, dioxyde de soufre ,ozone) des vapeurs de produits volatils ( benzène, solvants,vapeurs de mercure, tetrachlorure de carbone) des aérosols et des particules en suspension dans l'air. Certains gaz ( et vapeurs)sont ,au moins partiellement , retenus par le mucus de la muqueuse nasale ( ex. formaldéhyde).La plupart des gaz ( et vapeurs) inhalés sont résorbés au niveau pulmonaire par des mécanismes différents de ceux impliqués au niveau intestinal. Les molécules gazeuses se trouvant sous forme non ionisée et l'épithélium alvéolaire étant très fin, la diffusion de l'espace alvéolaire vers le sang et très rapide. Pr SLIMANI.M

Dans l'estomac les acides faibles, à l'inverse des bases faibles, sont Voie digestive Les toxiques pénètrent dans le tube digestif avec l'eau, les aliments . En dehors de produits particulièrement caustiques, les effets ne se produisent qu'après absorption. Dans l'estomac les acides faibles, à l'inverse des bases faibles, sont facilement diffusibles. Dans l'intestin ce sont les bases faibles qui sont les plus facilement absorbées. D'autre part à ce niveau, des phénomènes de transport actif peuvent intervenir pour certains toxiques (thallium, plomb). Le toxique passe par le foie qui est alors le principal organe d'inactivation et de transformation mais aussi le principal organe cible. Une particularité de l'absorption digestive est le métabolisme de premier passage : la substance toxique , absorbé au niveau du tube digestif, passe par le foie, atteint le cœur et après passage pulmonaire se distribue dans l'ensemble de l'organisme. Au niveau de la muqueuse intestinale et du foie, la substance toxique rencontre des enzymes susceptibles de le transformer en un ou plusieurs métabolites parfois actifs mais le plus souvent inactifs. C'est le métabolisme de premier passage (First past metabolism) . Pr SLIMANI.M

DIFFUSION ET DISTRIBUTION DES TOXIQUES Les toxiques transportés par le sang sont retrouvées : - Dans les hématies (composés apolaires tels le plomb, le monoxyde de carbones) -Dans le plasma sous diverses formes : soit libres dans le cas de substances polaires, soit liées aux protéines (albumines et lipoprotéines), dans le cas des molécules apolaires : -diffuser rapidement dans le secteur extracellulaire et seront facilement filtrés par le rein. - leur fraction libre plasmatique en équilibre avec la fraction liée vont pénétrer plus facilement en traversant les membranes cellulaires. Les composés lipophiles auront tendance à se localiser dans les territoires riches en lipides tels le système nerveux. Pr SLIMANI.M

Organes cibles Deux facteurs ont un impact important sur la distribution des xénobiotiques dans l’organisme : la perfusion sanguine des organes et l’affinité des xénobiotiques pour les tissus et les protéines plasmatiques . Les différents organes n’ont pas la même sensibilité aux toxiques du fait de leurs particularités métaboliques. La concentration du produit et/ou de ses métabolites intervient au niveau des spécificités d’action. La concentration dans les organes-cibles résulte des différentes étapes : absorption, distribution, biotransformation. Quand les cellules ont une grande affinité pour des molécules déterminées, cette particularité entraîne une absorption sélective de certains produits au niveau de certains organes. • Le foie et les reins du fait de leur forte mobilisation sanguine sont des sites de distribution importants. Pr SLIMANI.M

tissus adipeux : toutes les substances liposolubles tissus réservoirs tissus adipeux : toutes les substances liposolubles tissus spécifiques : ex. iode dans la thyroïde La séquestration physique est assurée par d'autres tissu: par exemple le plomb, fluor et aluminium se fixent sur les os. De nombreux composés hydrophobes comme le DDT, les biphényles poly halogénés (PCB), certains plastifiants peuvent être stockés dans le tissu adipeux, soit à l'état natif, soit après un certain métabolisme (fixation d'acide gras, incorporation dans des triglycérides ou des phospholipides). biphényles poly halogénés (PCB DDT Dichlorodiphényltrichloroéthane Pr SLIMANI.M

TOXICITE DIRECTE : Ce sont des produits doués d'une grande réactivité chimique. Ils agissent directement sur les organes cibles sans qu'aucune transformation . C'est le cas d'agents alkylants très réactifs ( sulfate de méthyle, diazométhane, formaldéhyde) , capables d'introduire sur une molécule donnée un groupement hydrocarboné de type alkyle. Au niveau cellulaire, les agents alkylants attaquent les protéines et les acides nucléiques, ce qui transforme ces constituants cellulaires en dérivés substitués qui sont modifiés et ne peuvent plus assurer normalement leurs fonctions. TOXICITÉ INDIRECTE La substance n’est pas toxique tel quel mais nécessite une métabolisation enzymatique préalable dans l'organisme (foie) pour qu’un effet toxique se manifeste. Des mécanismes enzymatiques de métabolisation existent également dans d'autres organes (reins, cerveau, placenta, poumons, peau, cavité nasale...). Ceci explique la toxicité sélective de certains composés. Leur interaction avec les protéines amènera à une nécrose plus ou moins réparable, à des atteintes immunitaires . tandis que l'interaction avec les acides nucléiques (ADN) pourra déclencher l'apparition d'une mutation suivie éventuellement d'un processus tumoral. Pr SLIMANI.M

Principaux mécanismes d’action toxique xénobiotique Biotransformation Détoxification Toxicité directe Biotoxification Toxicité indirecte Elimination Métabolite réactif Toxicité cible Interaction macromolécules biologiques (Protéines , lipides, ou Acide nucléiques) Principaux mécanismes d’action toxique Pr SLIMANI.M

Biotransformation des toxiques Lorsqu’un xénobiotique pénètre dans l’organisme , il est soit éliminé sous forme inchangée , soit métabolisé (ou biotransformé) par des réactions de fonctionnalisation (oxydation , réduction et hydrolyse ) suivies de réactions de conjugaisons . Les réactions de biotransformation se produisent au niveau du foie, des poumons, de l’estomac, de l’intestin et des reins. Dans la majorité des cas , les composés obtenus sont moins réactifs et plus hydrosolubles, facilement éliminables (molécules plus polaires) par filtration simple au niveau du rein. - Les réactions de biotransformation peuvent dans certains cas donner naissance à des composés fortement électrophiles , capables de réagir avec les groupements nucléophiles des macromolécules biologiques (protéines , lipides ou acides nucléiques. Pr SLIMANI.M

- Phase I :Réactions de fonctionnalisation , catalysent les réactions Le métabolisme des xénobiotiques se décompose en 03 phases qui aboutissent au final à l’élimination des substances étrangères dans la bile et l’urine. - Phase I :Réactions de fonctionnalisation , catalysent les réactions d’oxydoréduction et d’hydrolyse ; - Phase II : Réactions de conjugaisons avec un ligand comme les sulfates, l’acide glucuronique, l’acétate ou le glutathion . -Phase III : les transporteurs de la phase III (P-glycoprotein ou Pgp, multidrug resistance proteins ou MRP...) transportent au travers des membranes des xénobiotiques, et surtout des dérivés conjugués. ROH O2 ROH Phase I Phase II Phase III XH XOH XOR XOR CYP 450 GST MRP PgP XOH Elimination Pr SLIMANI.M

Les réactions de phase I sont des réactions : d’oxydation qui impliquent des mono-oxygénases telles que le cytochrome P450. Les enzymes du métabolisme des xénobiotiques, dont les cytochromes P450 (CYP ou P450), jouent un rôle central dans les phénomènes de biotransformation, du métabolisme et/ou de la détoxication de ces composés étrangers à l’organisme. Elles ont essentiellement lieu au niveau des microsomes hépatiques. - de réduction - d’hydrolyse qui ont lieu au niveau des organes (rein, foie, intestin, poumon..) . Les estérases impliquées dans les réactions d’hydrolyse ne sont pas spécifiques. -Les métabolites formés par les réactions de phase I ont des groupes fonctionnels hydroxyles (OH), amines (NH2) ou carboxyles (COOH) qui peuvent ensuite être conjugués par les réactions de phases II. Pr SLIMANI.M

•Réactions de la Phase I : CYP450 Les cytochromes P450 ( CYP ) forment une superfamille de mono-oxygénases. Ils sont présents dans le foie dans les microsomes hépatiques mais aussi dans l’intestin, les reins, les poumons .Ce sont des protéines à noyau hème (hémoprotéine) qui catalysent des réactions d’oxydation nécessitant de l’oxygène et du NADPH. Il existe un grand nombre d’isoformes du cytochrome P450 CYP ou P450 (Substrat )XH + O2 + NADPH+H+ XOH( substrat oxydé) + NADP+ +H2O – ces enzymes sont appelées mono-oxygénases, car elles incorporent un atome d’oxygène à partir d’oxygène moléculaire. Elles transforment une grande variété de composés chimiques Certains CYP catalysent le métabolisme d’un nombre limité de structures chimiques ROH :Substrat oxydé H2O RH : Substrat Pr SLIMANI.M

cycle catalytique du cytochrome P-450 P450 = Hème + Apoprotéine Hème = protoporphyrine + fer

-CYP1A2: Amines aromatiques, dioxines Ces enzymes jouent un rôle majeur dans le métabolisme des xénobiotiques et ont un rôle primordial dans la protection de l’organisme contre les agressions extérieures (polluants, pesticides). Les cytochromes les plus souvent impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques sont les CYP 1A2, CYP 2A6, CYP 2B6, CYP 2C, CYP 2D6, CYP 2E1, et le CYP 3A ces enzymes représentent plus de 90% de toutes les enzymes P450. -CYP1A1 métabolise des hydrocarbures aromatiques comme le naphtalène, l’anthracène, le benz (a)anthracène -CYP1A2: Amines aromatiques, dioxines -CYP2E1 :alcools, nitrosamines, trichloréthylène, chloroforme, benzène -CYP3A4 :aflatoxines , alcaloïdes Le CYP 2A6 semble jouer un rôle important dans le métabolisme de la nicotine et dans l’activation d’une nitrosamine spécifique du tabac Pr SLIMANI.M

Phase II: Réactions de conjugaison Le processus de conjugaison consiste à établir un lien entre un groupement fonctionnel d'un principe actif ou d'un métabolite généré dans la phase I et une molécule polaire endogène telle que l'acide glucuronique, la glycine , les ions sulfate, acétate , le groupement méthyle et le glutathion. Ces réactions sont catalysées par les transférases. Les composés formés sont très souvent inactifs, hautement polaires et très hydrosolubles. Ils sont donc rapidement excrétés par le rein dans les urines et par la bile dans les fèces. Différents enzymes de la phase II: UDP glucosyl transférases , Sulfotransférases, Glutathion S transférases, N acétyl transférases , conjugaison aux acides aminés (glycine , acide glutamique ), réactions de methylation R-OH R-O-acide glucuronique (glucuronoconjugaison) R-NH2 R-NH-COCH3 (N-acétylation) R-OH R-O-SO 3- (sulfatation) Pr SLIMANI.M

Réactions de la phase III: Les réactions de phase III font intervenir des transporteurs actifs multi-spécifiques d’efflux , principalement la P-glycoprotéine (P-gp) et les multidrug resistance -associated proteins ( MRP) qui appartient à la famille des transporteurs ABC (ATPbinding cassette) , se situent sur la face apicale (de l’entérocyte vers la lumière intestinale) ou basolatérale de la cellule(de l’entérocyte vers le sang) et transportent au travers des membranes des xénobiotiques polaires et/ou de leurs métabolites conjugués hydrophiles en vue de leur élimination active de la cellule. La P-gp intervient dans l'absorption intestinale des molécules en limitant le passage de la lumière intestinale vers les entérocytes . Elle contribue à une diminution de la biodisponibilité orale de ses substrats. La P-gp fonctionne comme pompe d’efflux dépendant de l’ATP . Elle est responsable de l’expulsion hors de la cellule de nombreuses molécules. En éliminant des substances endogènes et exogènes potentiellement toxiques, la P-gp protège ainsi l’organisme. Elle est exprimée principalement dans les organes et les tissus suivants : intestin, foie, barrière hémato encéphalique, placenta, rein, lymphocytes. Pr SLIMANI.M

Devenir des xénobiotiques : La détoxication se fait par hydrolyse , oxydation puis conjugaison dans le foie. Les produits obtenus sont moins toxiques , plus hydrosolubles : leur élimination par voie urinaire , digestive et respiratoire Séquestration physique de produits non biodégradables ou de leurs métabolites ,est effectuée par le tissu adipeux lorsque le toxique est lipophile :DDT, biphényles polyhalogénés (PCB : polychlorobiphényle) , dioxines. Ces transformations métaboliques conduisent à une bioinactivation ou au contraire à une bioactivation ou biotoxification Inactivation, détoxification :Les biotransformations inactivent nombreux composés par blocage chimique des groupements responsables du toxique. Par une augmentation de la polarité des xénobiotiques biotransformés. Les biotransformations aboutissent en général à la fixation de groupements polaires. Etude de la biotoxification : La formation de métabolites plus toxiques que la molécule initiale. L’activation métabolique est assurée par les systèmes enzymatiques Ces réactions peuvent conduire à une détoxication ou à la formation de métabolites plus toxiques que le substrat ( activation toxique). Pr SLIMANI.M

Exemple de détoxification : conjugaison par le glycocolle La principale voie du métabolisme du toluène est celle de l’hydroxylation en alcool benzylique par la chaîne des enzymes de la famille du cytochrome p450 (CYP2E). L’alcool benzylique qui , en présence d’enzyme (alcool déshydrogénase) conduit au benzyladéhyde , oxydé à son tour par une aldéhyde déshydrogénase en acide benzoique . L'acide benzoïque est métabolisé soit en glucuronide de benzoyle ou en acide hippurique. Le glucuronide de benzoyle est produit par la réaction de l'acide benzoïque avec l'acide glucuronique (glycuroconjuguaison), qui représente 10-20 % de l’élimination de l'acide benzoïque.L’acide hippurique est le principal métabolite urinaire du toluène . principal métabolite éliminé dans les urines . O2 O2 Toluène Alcool benzylique Benzaldéhyde Cyt P450 NADPH Cyt P450 NADPH NADH Aldéhyde déshydrogénase glyco conjugaison Acide benzoique Acide hippurique Glycocolle + H2O

Etude de la biotoxification Formation de métabolites plus toxiques que les substances initiales . Exemple 2 : -la désulfuration oxydative des esters phophorothionates tel que le parathion , un faible inhibiteur des cholinestérases , au contraire , le paraxon , produit de la désulfuration oxydative , un puissant inhibiteur des cholinestérases. - Hydroxylation de bromobenzène, donnant naissance à des métabolites responsables de la nécrose hépatique. Réduction des dérivés nitrés aromatiques et hydroxylation des amines aromatiques donnant naissance à des métabolites hémolytiques. Pr SLIMANI.M

Exemple 3 : le Le Benzo[a]pyrene -Lorsque des molécules génotoxiques pénètrent dans l’organisme , des mécanismes de métabolisation ( action des CYP450) transforment les molécules chimiques en composés réactifs qui sont capables de se lier à l’ADN .En s’accrochant à l’ADN , ces composés activés donnent naissance à des adduits. Les adduits formés fragilisent l’ADN et sont représentatifs de dommages à l’ADN :effet génotoxiques. Exemple : Lorsqu’il est ingéré ou inhalé, le Le Benzo[a]pyrene, un hydrocarbure polycyclique aromatique , est transformé par le cytochrome P450 (CYP1A1 ) et l’époxyde hydrolase en différents métabolites, dont le benzo[a]pyrène-7,8-9,10 diol époxyde (BPDE). Ce composé, très électrophile, responsable de la formation d’adduits sur les sites nucléophiles de l’ADN pouvant provoquer des mutations ( modifications du patrimoine génétique) dont une des conséquences peut être sa transformation en cellule cancéreuse . Pr SLIMANI.M

BPDE Métabolisme du benzo(a)pyrène : Adduit du BPDE avec une des bases de l’ADN

Autres cas de toxicité indirecte :Intoxication médicamenteuse est l'absorption d'un produit chimique avec une activité pharmacologique a des doses supérieures aux doses normales ou en cas de prise inappropriée. Exemple 1 : Le paracétamol, ou acétaminophène, est un des analgésiques et antipyrétiques . Aux doses thérapeutiques, la voie principale de métabolisation de l’acétaminophène est la sulfo- ou glucuronoconjuguaison, qui conduit à l’élimination du produit. Une faible proportion est oxydée en NAPQI, qui est détoxifié et éliminé de l’organisme après conjugaison avec le glutathion. Cependant , a forte dose , ce médicament peut entraîner des effets hépatiques graves . Ce n’est pas l’acétaminophène en lui-même qui est toxique, mais son métabolites, le N-acétyl-p-benzoquinone imine( NAPQI) , formé par action des P450 (CYP2E1-CYP3A4). Cependant, après ingestion de doses toxiques, la prise en charge par le glutathion étant insuffisante , le NAPQI , métabolite réactif va se lier de façon covalente aux protéines au niveau hépatique et qui se traduit par une nécrose au niveau centro lobulaire . Pr SLIMANI.M

ELIMINATION DES TOXIQUES Plusieurs voies d'excrétion existent dont les plus importantes sont : rénale (l'urine), gastro-intestinale (les selles), pulmonaire (l'air expiré), cutanée (la sueur) ou lactée (le lait). Élimination rénale : Le rein qui reçoit à pression élevée environ 1400 ml/mn de sang, soit le quart du débit cardiaque, élimine les médicaments comme diverses autres substances de l'organisme. Le rein est un organe spécialisé dans l’excrétion de nombreux toxiques et métabolites hydrosolubles, permettant de maintenir l’homéostasie de l’organisme. Chaque rein possède environ un million de néphrons capables d’assurer cette excrétion. L’excrétion rénale est un mécanisme très complexe comprenant trois processus: la filtration glomérulaire au niveau de la capsule de Bowman; le transport actif au niveau du tube proximal; le transport passif au niveau du tube distal. L’excrétion d’un toxique par la voie urinaire dépend du coefficient de partage de Nernst, de la constante de dissociation et du pH urinaire, de la taille et de la forme de la molécule, de sa transformation en métabolites plus hydrophiles et de l’état de la fonction rénale. Pr SLIMANI.M

Excrétion biliaire et fécale : Les grosses molécules et les molécules non hydrosolubles qui ne peuvent pas être excrétées par le rein sont éliminées par cette la voie biliaire. Au niveau hépatique , les molécules peuvent être transformés en composés conjugués hydrophiles , couplés à des groupements polaires (acide glucuronique, acide sulfurique ou à d'autres molécules : réactions de conjugaisons) . Les produits conjugués hydrophiles ,peuvent être sécrétés dans la bile , par les voies biliaires et aboutissent de nouveau à l'intestin par le canal cholédoque. Au niveau de l’intestin, Les principes actifs conjugués sous forme de glucuronides vont être hydrolysés par la flore bactérienne intestinale , sous l’action de la glucuronidase , et redonner la molécule initiale ( molécule libre déconjuguée : sans le groupement polaire ) à nouveau réabsorbée et rejoint la circulation générale et excrétés ultérieurement. Pr SLIMANI.M

médicament Tube digestif Lumière Veine porte foie bile Intestin Médicament conjugué Médicament déconjugué ( molécule initial) Féces Cycle entéro- hépatique Voie pulmonaire : Elimination de substances volatiles : solvants , alcool. Cette voie concerne plus particulièrement les gaz et les liquides volatils. L’élimination des toxiques se fait par diffusion à travers les membranes cellulaires. Les poumons représentent une voie importante d'excrétion des substances, ou de leurs métabolites, s'ils sont présents dans le sang sous forme gazeuse. Les gaz sanguins sont excrétés par diffusion passive à partir du sang vers les alvéoles, les gaz les moins solubles étant mieux éliminés. Les liquides volatils, dissous dans le sang, sont excrétés par l'air expiré à un taux qui est fonction de leur tension de vapeur. Autres voies : Le lait maternel est une voie d'élimination des composés basiques du fait de l'acidité du lait et des composés lipophiles. La salive et la sueur sont des voies d'excrétion mineures

La phase toxico dynamique Notion de récepteur moléculaire Le récepteur physiologique possède 2 propriétés fondamentales - Il reconnaît spécifiquement un agent toxique. - Il produit un effet biochimique ou biophysique en réponse à la fixation de cet agent toxique La quasi-totalité des substances toxiques est électrophile ou le devient après bio transformation. Les récepteurs moléculaires sont donc des sites nucléophiles.(Radicaux contenant des hétéros atomes OH, SH, NH-,… portés par des biomolécules ADN, ARN, protéines… -Les macromolécules biologiques (ADN, ARN, protéines) sont riches en sites nuléophiles et sont des récepteurs de choix pour des toxiques électrophiles. Les lipides insaturés sont également des sites d’attaque privilégiés des agents toxiques Les sites nucléophiles des protéines sont représentés par quelques acides aminés riches en électrons ; histidine , cystèine, lysine , tyrosine , tryptophane , méthionine, ces acides aminés réagissent avec les cancérogènes Les acides nucléiques, la nature des substituants des bases de ces acides nucléiques : les hydrocarbures attaquent le groupe aminé de la guanine Pr SLIMANI.M

Effet réversible et effet irréversible Action toxique sur les biomolécules Effet réversible et effet irréversible Les effets réversibles disparaissent dès que l’exposition à la molécule toxique cesse. Les effets irréversibles persistent voire progressent après la phase d’exposition. -Action basée sur liaison réversible (non covalente):la propriété fondamentale de cette action est qu’elle est liée a la concentration du toxique les fluides de l’organisme et que cette action disparaît avec l’élimination du toxique. Le facteur temps est un paramètre important , à cause des longueurs de la phase d’expositions. Parmi les toxiques ayant une liaison réversible avec leur site moléculaire :les pesticides organophosphorés , les pesticides carbamates Pr SLIMANI.M

-Action basée sur une liaison irréversible : ce type de réaction s’intéresse les molécules chimiquement réactives , les effets toxiques dépend du type de biomolécules touché. Les toxiques sont en principe toujours activés avant d’exercer leur action et se sont les sites nucléophiles (NH2,SH) des biomolécules qui sont visés ;les liaisons sont covalentes et stable. Parmi les effets toxiques observés ,on range la mutagenèse, la cancérogenèse, la teratogénèse, la sensibilisation allergique(les radiations ionisantes). Effet immédiat ou aigu et effet retardé ou chronique Contrairement aux effets immédiats ou aigus qui apparaissent rapidement après l’exposition, certains effets apparaissent tardivement, comme par exemple l’effet cancérogène qui survient plusieurs années après l’exposition, dans ce cas il s’agit d’effet retardé ou chronique. Cette chronologie variable dans les effets est liée à la fois à la dose de toxique et au niveau d’exposition. Pr SLIMANI.M

Toxicité selon le mode d'action des toxiques Les toxiques ne produisent pas des effets de même intensité sur tous les organes. Des changements adaptatifs causés par un produit chimique dans un tissu ou un organe peuvent être accompagnés de changements fonctionnels et morphologiques. Pour un tissu tel que celui du foie, qui a une importante capacité de régénération, la majorité des atteintes sont réversibles ; au contraire, elles sont généralement irréversibles lorsqu'il s'agit d'une atteinte du système nerveux . Des effets tels que la cancérogénicité et la tératogénicité sont généralement considérés comme des effets irréversibles. Pr SLIMANI.M

1- Effet morphologique, fonctionnel ou biochimique -L’effet morphologique conduit à une modification tissulaire une nécrose ou une néoplasie. Il est généralement irréversible. -L’effet fonctionnel correspond à un changement des fonctions d’un organe. Il est en général réversible , le cas de la stéatose hépatique ( apparition de vésicules lipidiques dans le foie :macro sécrétion) ou l’hépatite. -Des altérations biochimiques peuvent également se produire sans être accompagnées de changements morphologiques apparents (ex. : l'inhibition des cholinestérases causée par les insecticides organophosphorés). Pr SLIMANI.M

Le gène peut être morcelé ou recombiné au niveau des segments d’ADN. 2-Mutagenèse Le phénomène de mutagenèse résulte d’interactions entre des agents mutagènes et le matériel génétique des organismes. -Les modifications chromosomiques correspondent à des anomalies de nombre (augmentation ou diminution) ou de structure (délétions, duplications, translocations) des chromosomes. Le gène peut être morcelé ou recombiné au niveau des segments d’ADN. Il y a une corrélation importante entre effets mutagènes et cancérogènes pour une même molécule . Exemple1 :L’action mutagène du méthylmercure est due à une fixation sur l’ADN, par son caractère électrophile du groupement CH3Hg+ qui se comporte comme un agent alkylant vis-à-vis des groupements azotés des bases nucléiques notamment de la thymine. Cette fixation aboutit à dénaturation de l’ADN qui explique des ruptures chromosomiques . Il entraîne une baisse de synthèse d’acides nucléiques et de protéines et il possède un pouvoir mutagène et antimitotique. Pr SLIMANI.M

3-CANCEROGENESE L'ADN des chromosomes du noyau cellulaire est la cible privilégiée des agents cancérogènes (produits chimiques, radiations ionisantes).Processus pathologique entraînant l’apparition de cellules malignes, envahissant progressivement les tissus et capables de migrer en provoquant l’apparition de foyers secondaires :métastases ( le cas des HAP ). 4- TERATOGENESE: Ce sont des substances qui agissent principalement sur l'embryon à des stades bien précis de son développement et qui induisent une ou des anomalies, se manifestant par des malformations. Exemple 1 :Apparition de malformations congénitales au cours du développement de l’embryon (ou embryogenèse) après exposition de la femme enceinte à des facteurs d’altération exogènes(Dioxines; Éthanol; Hg ) . Exemple 2:Le méthylmercure est tératogène et foetotoxique pour l'humain comme les composés alkylés à chaîne courte. Il traverse le placenta, se retrouve dans le lait maternel. Pr SLIMANI.M

Modification du nombre de cellules du système immunitaire. 5-IMMUNOTOXICITE Modification du nombre de cellules du système immunitaire. 2 types d’effets  : L’immunosuppression : augmente la sensibilité aux infections L’immunostimulation : se manifeste par le développement d’une maladie auto – immune ou par un syndrome allergique 6-Produits allergisants Ils déclenchent une réaction anormale du système de défense immunitaire. Il en résulte divers troubles variables selon la cible: eczéma, conjonctivite, asthme, bronchite .. 7- Produits pulvérulents L'inhalation prolongée de produits pulvérulents tels que la silice, l'amiante, peut entraîner une difficulté croissante à respirer. L'inhalation prolongée d'amiante peut entraîner des cancers ( broncho-pulmonaires) 8- Produits irritants Leur contact avec la peau ou les muqueuses provoque des réactions inflammatoires Pr SLIMANI.M

A+B <A effet B antagonise effet A : désensibilisation Synergie toxique : En toxicologie , la synergie et la potentialisation peuvent avoir des effets redoutable du point vue clinique -synergie : l’effet global de deux ou plusieurs substances est égale à la somme des effets séparés de chacune de ces substances E = A+ B+C -Potentialisation : l’effet global de ces substances est supérieur à la somme des effets séparés de chacune de ces substances : A (60%) +B (40%) > E(80%) effet B potentialise l’effet de A : sensibilisation- -Antagonisme: L’antagonisme est le contraire de la synergie. Il survient lorsque l'effet combiné d'au moins deux composés est moins toxique que les effets individuels des substances A+B <A effet B antagonise effet A : désensibilisation -Action coalitive est constatée lorsque chacune des substances prises individuellement ne produit pas d’effets toxiques, mais que leur combinaison est toxique. Par exemple : A(0) +B( 0) = effet toxique Pr SLIMANI.M

Mécanisme d’action des organophosphorés (OP)   Mécanisme d’action des organophosphorés (OP) Les OP peuvent être classés en trois groupes, selon la nature du groupe X : les aliphatiques (le malathion), les aromatiques (le parathion) et les hétérocycliques (la phosalone), ou selon la présence d’atomes de soufre : les organophosphorés (le dichlorvos), les thio-organophosphorés (le diazinon) et les dithio-organophosphorés (le malathion). Les aromatiques et les dérivés soufrés sont les plus persistants. Les OP, très lipophiles, franchissent toutes les barrières biologiques et se fixent de façon covalente aux cholinestérases du SNC, des muscles, des globules de la jonction synaptique des fibres du système nerveux central. Une faible quantité franchit la barrière hémato-encéphalique, inhibe l’ activité acetyl-cholinesterasique (AChE) de façon irréversible , en le phosphorylant, le site estérasique de l’enzyme, s’opposant ainsi a l’hydrolyse physiologique de l’acétylcholine en choline et en acide acétique. La phosphorylation devient irréversible par déalkylation ; c’est le phénomène d’« aging » ou vieillissement de l’enzyme qui devient, d’une part, non fonctionnelle et, d’autre part, non réactivable. Le résultat de l’inhibition des cholinestérases est l’accumulation d’acétylcholine . . Pr SLIMANI.M

Mécanisme d’action des pesticides organophosphorés -La concentration élevée de ACh provoque la contraction musculaire, aussi l'excès d'ACh peut être excitatrices (cause secousses musculaires), mais aussi d'affaiblir ou de paralyser la dépolarisation de la cellule par la fin de la plaque.. Mécanisme d’action des pesticides organophosphorés Pr SLIMANI.M

2-Mécanisme d’action des organochlorés ( OC): Les OC sont des composés organiques, obtenus par la chloration de différents hydrocarbures insaturés. Ces substances possèdent 3 à 9 substitutions par des atomes de chlore, responsables d’une stabilité chimique très élevée. -La plupart des organochlorés provoquent une hépatomégalie et qu’ils sont inducteurs des enzymes microsomiques lesquelles les transforment en époxydes hautement réactifs vis à vis des macromolécules protéiques et acides nucléiques ( exemple: hépatochlore qui est métabolisé en époxyde hépatochlore). DDT (dichlorodiphényltrichloroéthane) et HCH (Le lindane ) sont capables de traverser la barrière hémato-encéphalique et de s’accumuler dans le SNC . les organochlorés inhibent la Mg –ATPase et la pompe Na/k ATPase dépendante, enzymes respectivement associés aux phosphorylations oxydatives et au maintien des potentiels de membrane (activité nerveuse).Le DDT agit sur les nerfs moteurs et sensitifs et sur le cortex moteur inhibe ouverture des canaux potassium voltage dépendant et la fermeture des canaux sodium .Ces divers mécanismes d’action seraient responsables de la neuro toxicité des organochlorés Endosulphane agirait comme un antagoniste non compétitif du GABA , principal neurotransmetteur inhibiteur du SNC. Pr SLIMANI.M

3-Action sur la biosynthèse de l’hème : le Plomb Le plomb se concentre dans la moelle osseuse où sa concentration est 50 fois supérieure à celle du sang perturbant ainsi la biosynthèse de l’hème. Cette biosynthèse de l’hème s’effectue dans la moelle osseuse a partir du Succinyl Coenzyme A et du glycocolle. Les enzymes inhibés par le plomb : L’inhibition de l’Ala déhydratase entraine une élimination accrue de l’acide amino lévulinique dans les urines. lL’inhibition de la coproporphyrinogène décarboxylase se traduit par une augmentation de l’élimination des coproporphyrines urinaires .Elle est à l’origine de l’apparition de granulations basophiles dans les hématies L’inhibition de l’hème synthétase (ferrochélatase)entraine l’apparition dans le sang de protoporphyrines qui se lient au zinc pour donner un complexe stable appelé protoporphyrine zinc (PPZ). Ces anomalies dans la formation des hématies, entraînent une diminution de leur durée de vie et à la longue une anémie marquée. Pr SLIMANI.M

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4-Découpleurs de phosphorylation oxydative (PO) La chaîne respiratoire est localisée dans la membrane interne mitochondriale . Cette chaîne de transport d'électrons est constituée de quatre complexes protéiques -complexe I : NADH-coenzyme Q oxydoréductase, récupérant les électrons du NADH et permet le transport de 4 protons de la matrice mitochondriale à l’espace inter membranaire. La rotenone, utilisée comme insecticide, bloque le complexe I. -complexe II : succinate - coenzyme Q oxydoréductase, recupérant les électrons du FADH2 .Le malonate un inhibiteur du complexe II, compétitif vis à vis du succinate. -le coenzyme Q (ubiquinone), permet la transition entre le complexe I ou II et le complexe III. -complexe III : coenzyme Q-cytochrome C oxydoréductase, permet le transport de 4 protons de la matrice mitochondriale à l’espace inter membranaire -le cytochrome c :sont des transporteurs mobiles de la chaîne respiratoire, permet la transition entre le complexe III et le complexe IV -Le complexe IV, : cytochrome C oxydase, oxyde le cytochrome C ferreux en cytochrome C ferrique, réduit l'oxygène en eau et pompe des protons de la matrice vers l'espace intermembranaire . -ATP synthase, utilise l'énergie du gradient du potentiel électrochimique des protons pour la synthèse de l'ATP (inhibée par l’Oligomycine).

Les mécanismes de la chaîne respiratoire et de la synthèse d’ATP par phosphorylation oxydative Les agents découplants (dinitrophénol DNP , carbonylcyanide m-chloro phenylhydrazone (CCCP), carbonylcyanide-p-trifluorometoxy phenylhydrazone ,FCCP) induisent une fuite de protons non spécifique à travers la membrane interne mitochondriale et abolissent le lien entre la chaîne respiratoire et le système de phosphorylation résultant en un flux de protons vers la matrice . Pr SLIMANI.M

Exemple : Le 2,4 dinitrophénol (2,4 DNP) est un agent découplant de la phosphorylation oxydative , qui pénètre dans la matrice et augmente fortement la consommation d’oxygène, est dissous dans les lipides de la membrane interne de la mitochondrie qu’il rend perméable aux protons (ionophores) . Cette fuite de protons à travers la membrane, entraîne la diminution du gradient de protons transmembranaire. Par suite les oxydoréductases de la chaîne respiratoire accélèrent leur pompage de protons et donc les oxydations couplées, provoque l'effondrement du gradient électrochimique que la cellule utilise pour produire l’énergie chimique de la plupart des molécules d’ATP . Ne disposant plus du gradient suffisant pour fournir l’énergie dont elle a besoin pour la phosphorylation de l’ADP, elle catalysera la réaction dans l’autre sens, hydrolysant l’ATP en ADP et en phosphate en utilisant le reste de l’énergie pour pomper des protons de la matrice vers l’espace inter membranaire et libérer de la chaleur dans le milieu. L’énergie produite au cours des oxydations cellulaires ne peut pas être mise en réserve sous forme d’ATP .Il s’installe donc une carence en ATP avec perturbations de nombreux métabolismes. -Le cyanure bloque le transfert d’électrons au niveau du complexe IV par combinaison avec le fer ferrique Fe3+. Pr SLIMANI.M

5- Perturbateurs endocriniens : Les molécules présentant des effets de perturbateurs endocriniens, la dioxine,les pesticides organochlorés ou organophosphorés et les PCB(polychlorobip hényls). Les perturbateurs endocriniens sont des substances chimiques d’origine naturelle ou artificielle étrangères à l’organisme qui peuvent interférer avec le fonctionnement du système endocrinien et induire ainsi des effets délétères sur cet organisme ou sur ses descendants .  Conséquences potentielles pour l'organisme, propres à chaque perturbateur endocrinien : altération des fonctions de reproduction, malformation des organes reproducteurs, développement de tumeurs au niveau des tissus producteurs ou cibles des hormones (thyroïde, sein, testicules, prostate, utérus), perturbation du fonctionnement de la thyroïde, du développement du système nerveux, modification du sex-ratio. Pr SLIMANI.M

les mécanismes d'actions de ces substances.: -modifier la production naturelle des hormones naturelles (œstrogènes, testostérone) en interférant avec leurs mécanismes de synthèse, de transport, ou d'excrétion ; – mimant les effets des hormones naturelles en se fixant sur le récepteur hormonal . C'est l'effet agoniste   – antagonisant les effets des hormones naturelles par blocage de leur liaison avec le récepteur hormonal ; elle entrave alors l'action des hormones. C'est l'effet antagoniste -altérant le taux de récepteur hormonal disponible et en interférant avec le transport et l’élimination des hormones ainsi modifier les concentrations d'hormones naturellement présentes dans l'organisme – empêchant l’internalisation et donc la liaison du complexe hormone/récepteur avec l’ADN ; – occupant directement le site de l’élément de réponse au complexe hormone/récepteur de la région promotrice ; – modifiant la structure du site de l’élément de réponse au complexe hormone/récepteur de la région promotrice. Les perturbateurs pourraient interférer avec le patrimoine génétique, en modifiant l’expression des gènes et en augmentant la prédisposition à certaines maladies. Pr SLIMANI.M

Toxicologie cellulaire : 1-Action caustique : Le terme caustique s’applique à toute substance susceptible du fait de son pH ou de son pouvoir oxydant d'induire des lésions tissulaires. Les produits caustiques peuvent être des acides (acide ( pH< 2), des bases(pH > à 13) ou des oxydants. Les acides concentrés à pH< 2 (acide chlorhydrique, sulfurique, nitrique) , induisent ,par l’action des ions H+ , une dénaturation protéique responsable d’une nécrose par coagulation des tissus superficiels de l’épithélium de la paroi digestive. -les bases fortes à pH > à 13 ( soude, potasse, ammoniac) dissolvent les protéines et le collagène , saponifient les lipides. Elles provoquent une nécrose et une pénétration lente en profondeur. Le risque hémorragique est important. Leur viscosité favorise les lésions oesophagiennes. -Les oxydants (eau de javel) l’action des oxydants puissants : peroxyde , sels très oxygyénés (MnO4) provoquent des réactions exothermiques (oxydation , chlorination) responsables de brulures thermiques et une dénaturation protéique avec transformation des acides aminés en aldéhydes. Des lésions sévères s’observent notamment sur l’estomac Pr SLIMANI.M

-2-détruite par un toxique générateur de radicaux hydroxyle OH Les radicaux oxydants libérés dans la cellule entraînent des lésions directes de l'ADN ; l'interaction de radicaux oxydants avec les lipides constituant les membranes intracellulaires déclenche le processus dit de peroxydation lipidique. -3-détruite par un toxique qui inhibe le fonctionnement de certaines structures (mitochondries) apportant de l’énergie chimiques aux organites : 3-1 -inhibition de l’apport énergétique, blocage d’un élément de la chaîne de dégradation des glucides, du carrefour pyruvique, du cycle de Krebs, de la chaîne de transfert de H+ à l’oxygène. -inhibition du couplage oxydo-phosphorylant de la chaîne d’apport énergétique au mécanisme des phosphorylations et de la production des nucléotides utilisables comme donneurs d’énergie ATP ( exemple DNP). Pr SLIMANI.M

3-2-l’élévation de la concentration cytosolique en Ca2+ (Ca2+i): à l’origine du développement de la toxicité cellulaire. Certaines toxines provoquent une augmentation de la concentration cytosolique du calcium. Cette augmentation des concentrations intracellulaires de calcium ionisé entraîne une augmentation non spécifique de la perméabilité membranaire et une entraîne l'activation de nombreuses enzymes de dégradation, comme des endonucléases capables de dégrader l'ADN, des protéases capables de dégrader les protéines intracellulaires et certaines phospholipases capables de dégrader les lipides des membranes cellulaires. Pr SLIMANI.M

-un arrêt de la plupart des fonctions cellulaires essentielles, 3-3 la déplétion en ATP et/ou la diminution du rapport ATP/ADP : à l’origine des atteintes mitochondriales directes ou indirectes et entraînent : -des troubles concernant toutes les activités cellulaires nécessitant de l’énergie, et notamment l'ensemble des réactions biochimiques couplées à une hydrolyse de l'ATP en ADP + Pi, réactions qui s'inscrivent fréquemment dans le cadre de l'anabolisme, -un arrêt de la plupart des fonctions cellulaires essentielles, -une élévation du Ca2+i par inhibition des ATPases contrôlant l ’homéostasie calcique. -Lésions mitochondriales irréversibles : pouvant être induites par une augmentation du calcium, un stress oxydatif, par une destruction des phospholipides, elles sont une clé de la mort cellulaire. -Perturbation des échanges ioniques entre le milieu intracellulaire et l’extérieur de la cellule  Pr SLIMANI.M

l’une des fonctions endocellulaires nécessaires a las survie : -4-détruite par un toxique qui inhibe ou altère une structure indispensable à l’une des fonctions endocellulaires nécessaires a las survie : -DNA et mécanismes de synthèse des protéines, -membrane cellulaire : altérations de la perméabilité ,perforation -biomédiateurs sous membranaire : fonctionnement déréglé -lysosomes-estérases , lyse locale -sites à férritine ( formation de radicaux OH−) avec lyse locale le fer est apporté dans l’organisme et transféré vers les hèmes par l’intermédiaire de transporteurs : les férritines , protéines dont les plus importantes se trouvent dans le foie et la rate). -5-Altérée dans son fonctionnement prolongé : avec un résultat fonctionnel irréversible ,altération d’enzymes qui secondairement «  vieillissent » ; réduction de l’effet ou de la production de facteurs de croissance ou de production. Pr SLIMANI.M

Le stress oxydatif Les radicaux libres sont produits en permanence par l'organisme, à partir d'oxygène dans la cellule, notamment au niveau de la mitochondrie, dans la chaîne respiratoire. Ces substances issues de l’oxygène sont générées sous l’effet d’oxydants ( le tabac, les médicaments chimiothérapeutiques , les rayonnements ionisants, Le tabagisme, la pollution etc) peuvent induire des modifications de la structure de la macromolécule qui peuvent avoir des conséquences biologiques importantes . Les radicaux libres sont des espèces chimiques qui possèdent un électron non apparié, ce qui les rend apte à réagir avec diverses molécules et engendre ainsi des dommages cellulaires importants comme c’est le cas pour le radical hydroxyle. Le stress oxydant est observé lorsque la production des espèces oxygénées réactives (ERO) dépasse les capacités de défense des tissus. Il entraîne des altérations des composants cellulaires par réactions chimiques des espèces oxygénées réactives avec les lipides, les protéines et les acides nucléiques cellulaires H2O e- +H+ e- +2H+ e- e- +H O2.- anion superoxyde H2O2 peroxyde d’hydrogène OH. radical hydroxyl H2O O2 Oxydation Protéines Peroxydation lipidique Oxydation ADN Pr SLIMANI.M

Peroxydation lipidique Les premières cibles des EOA sont les lipides, notamment ceux présents dans les membranes cellulaires et subcellulaires. Les membranes riches en acides gras polyinsaturés (AGPI) sont très sensibles à l'oxydation en raison de leur degré élevé d'insaturation. Les radicaux hydroxyles, sont susceptibles d’interagir au niveau des doubles liaisons C=C avec les chaînes d’acides gras polyinsaturés qui constituent le double feuillet phospholipidique des membranes , ils entrainent la peroxydation des acides gras polyinsaturés provoquant une désorganisation membranaire (perturbation des propriétés physicochimiques des membranes, des communications intercellulaires et du fonctionnement des enzymes membranaires) . Les hydroperoxydes lipidiques ((ROOH) formés sont dégradés principalement en malonedialdéhyde (MDA) et 4- hydroxynonénal (4-HNE) qui réagissent de manière covalente avec les protéines et les inactivent) . Le produit de la péroxydation , le malonedialdéhyde (MDA) qui altère la fluidité et la fonction des membranes, dont la composition en acides gras insaturés module l’oxydabilité , est détecté par l’acide thiobarbiturique (formation de thiobarbituric acid reactants ou TBARS) . Pr SLIMANI.M

Oxydation des protéines Les acides aminés les plus réactifs vis-à-vis des EOA sont l’histidine, la proline, le tryptophane, la cystéine et la tyrosine. L’oxydation de ces acides aminés, entraînent des modifications structurales des protéines, facilitant de ce fait leur agrégation ou leur digestion par les protéases. Toute attaque radicalaire d’un acide aminé provoquera l’oxydation de certains résidus avec, pour conséquences, l’apparition de groupements carbonylés, des clivages de chaînes peptidiques et des ponts bi-tyrosine intra- et inter-chaînes. - Les carbonyles sont utilisés comme un marqueur de l’oxydation des protéines et de façon générale comme un marqueur du stress oxydant. La plus utilisée est celle qui met en œuvre la réaction entre les produits carbonylés et la 2-4-dinitrophénylhydrazine(DNPH) conduisant à la formation de 2-4-dinitrophénylhydrazones . Celles-ci peuvent être mesurées par spectrophotométrie . Protéine oxydée non fonctionnelle Protéine active Oxydation Pr SLIMANI.M

Les altérations de l’ADN : Les principales classes de dommages d’ADN causées par les EOA : -les coupures simples (1 seul brin est cassé au niveau de la liaison désoxyribose-base ou désoxyribose-phosphate) et doubles brins : résultant essentiellement d’une déshydrogénation du désoxyribose -Les modifications des bases azotées en particulier la guanine, cela entraine un non-appariement des bases (guanine modifiée par la 8 OH-2’-deoxyguanosine, 8-OHdG qui est un marqueur des dommages oxydatifs de l’ADN). les pontages ADN-ADN (inter-brin et intra-brin) et ADN-protéines et les sites abasiques (site AP :site apurinique/apyrimidique)est un emplacement de l'ADN où la base (purine ou pyrimidine) est due à la rupture de la liaison N-glycosidique entre le désoxyribose et la base azotée , conduit au relargage de la base et par conséquent à l’apparition d’un site apurinique /apyrimidique non codant ( site abasique), est hautement cytotoxique et mutagène. Marqueur de l’oxydation de l’ADN ( 8 OH-2’-deoxyguanosine ): Les EOA peuvent réagir avec la guanine, base constitutive de l’ADN, pour la transformer en 8-hydroxy–2’ déoxyguanosine(8-OH2DG) qui, au lieu de s’apparier avec la cytosine, s’associera avec l’adénine, entraînant des mutations au sein de l’ADN et conduisant à des altérations du message . Pr SLIMANI.M

Les systèmes enzymatiques Les principaux systèmes enzymatique qui existent à l’état endogène, défendent les cellules contre les radicaux libres -Les superoxyde dismutases (SOD) : Les superoxyde dismutases sont capables d’éliminer l’anion superoxyde en produisant une molécule d’oxygène et une molécule de peroxyde d’hydrogène.Le peroxyde d’hydrogène formé est pris en charge par les catalases (présentes en particulier dans les hématies et les peroxysomes hépatiques) et les glutathion peroxydases à sélénium. O2 -. + O2-. + 2H + H2O2 + O2 -La catalase est également responsable de l'élimination d' H2O2 par une transformation en H2O et O2 2 H2O2 → 2 H2O + O2 -Les glutathion peroxydases (Gpx) : Toutes les glutathion peroxydases contiennent dans leurs sous-unités un à quatre atomes de sélénium selon l’isoenzyme , dégradation des peroxydes organiques et du peroxyde d’hydrogène 2GSH (réduit) + H2O2 GSSG + 2H2O 2GSH + R-OOH GSSG + H2O + R-OH Peroxydase GSH : glutathion réduit GSSG : glutathion disulfide (S-S) (qui à son tour sera réduite par l'intermédiaire de la glutathion réductase ) . Pr SLIMANI.M

Les systèmes antioxydants non enzymatiques -Les molécules antioxydantes ou piégeurs de radicaux libres : la vitamine E connue pour son activité anti radicalaire très puissante ; les vitamine E,C, les caroténoïdes, agissent en piégeant les radicaux et en captant l’électron célibataire, les transformant en molécules ou ions stables . Des composés endogènes jouent le même rôle, dont le glutathion réduit qui protège non seulement contre les radicaux libres, mais aussi contre les peroxydes. D’autres composés antioxydants comme les métallothionéines. -les métallothionéines (MT) Les MT sont des protéines de faibles masses moléculaires (6 kDa), riches en cystéines , ce qui leur permet de complexer les cations métalliques par les groupements thiols .Les métallothionéines diminuent ainsi la disponibilité des métaux lourds dans la cellule ce qui réduit sa toxicité. Pr SLIMANI.M

- Mesure du glutathion réduit , un marqueur de stress oxydatif . Le glutathion, un tripeptide (γ-glutamyl-cysteinyl-glycine), joue un important dans la détoxification des xénobiotiques potentiellement toxiques. Le glutathion réduit (GSH) peut s’oxyder en glutathion disulfide (GSSG) en présence de radicaux libres, ce qui permet la neutralisation de ces radicaux et donc de prévenir un stress oxydant. La détermination du ratio des deux formes (GSH et GSSG) constitue un paramètre important dans la caractérisation du statut oxydatif cellulaire. Le groupe sulfhydryle du glutathion réagit avec le DTNB (acide 5,5'-dithio-bis-2- (acide nitrobenzoïque) et produit le 5-thio-2-nitrobenzoïque qui est de couleur jaune (TNB). Le disulfure mixte, GSTNB (entre le GSH et TNB), produit de manière constante, est recyclé par la glutathion réductase à recycler pour donner du GSH. Au cours de ce recyclage, il y a production de plus de TNB. La mesure de l'absorbance à 405 nm du TNB fournit une estimation précise du GSH totaux dans l'échantillon .

METHODES D’ETUDES DE LA CYTOTOXICITE Plusieurs méthodes d’étude de la cytotoxicité : les méthodes fondées sur des perturbations de la perméabilité membranaire et les méthodes fondées sur des altérations de la prolifération cellulaire. Son but est de déterminer la concentration inhibitrice 50% (IC50) qui est la concentration qui inhibe de moitié la prolifération cellulaire globale. 1-Modification de la perméabilité de la membrane :Détermination de la viabilité cellulaire  -Une série de tests colorimétriques dont le principe repose sur la réduction de réactifs colorés , des sels de tétrazolium , par les déshydrogénases des cellules viables .Ces sels solubles vont être réduits lors de la réaction enzymatique pour donner du formazan. Ces tests à base de sels de tétrazolium sont présentés comme révélateur de l’activité mitochondriale car ils sont réduits par les succinates réductases du complexe II de la chaîne respiratoire mitochondriale. Il existe 3 types de colorants : les colorants vitaux ou d’exclusion (cellules mortes) les colorants supra vitaux ou d’inclusion (cellules vivantes) les colorants nécessitant une étape de métabolisation ( mesure des capacités métaboliques) .

1 -Test MTS Le test MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) est une méthode de dosage par colorimétrie utilisée pour évaluer la viabilité cellulaire grâce à l'activité déshydrogénase des mitochondries des cellules vivantes. Le réactif MTS de couleur jaune pâle peut traverser la membrane cellulaire. Dans la cellule, ce dernier est réduit par la succinate déshydrogénase des cellules vivantes actives en formazan. Ainsi, la quantité de formazan produite est proportionnelle au nombre de cellules viables. Le formazan, de couleur jaune foncé, est un composé soluble dans le milieu de culture cellulaire. La production de ce produit est suivie en mesurant l’absorbance par spectrophotométrie à 690 nm . La cytotoxicité a été calculée comme suit: Cytotoxicité (%) = [(DO des cellules contrôles - DO des cellules exposées aux NP) / (DO des cellules de contrôle)] x 100

2-TEST AU MTT Le test du MTTMTT (3-[4,5-diméthylthiazol-2yl]-2,5-diphényltétrazolium bromide), est un indicateur de l'intégrité et de l'activité mitochondriales assimilables à une mesure de la vitalité cellulaire . est un colorant de type tétrazolium qui est réduit par les enzymes mitochondriales (succinate déshydrogénase ) en un composé coloré en bleu . En présence du substrat, les sels de tétrazolium du substrat sont transformés en cristaux insolubles de formazan grâce à l'activité de la succinate déshydrogénase. La quantité de sel formazan produite par les cellules à partir du MTT est mesurée par spectrophotométrie à 540 nm. L’intensité de la couleur est directement proportionnelle au degré d’intégrité des mitochondries. Il s’agit d’un test utile pour détecter des composés cytotoxiques en général ainsi que les agents ayant les mitochondries pour cible spécifique.

Principe du test MTT MTT MTT formazen Succinate déshydrogénase

3-Test de PrestoBlue (résazurine ): Ce test utilise le pouvoir réducteur des cellules vivantes actives pour transformer le réactif résazurine (7-hydroxy-3H-phénoxazin-3-one 10-oxyde), un composé de couleur bleu perméable aux cellules et pratiquement non-fluorescent, en résorufine, un produit rouge fortement fluorescent. La résazurine est principalement utilisée comme un indicateur d'oxydo-réduction dans des analyses de viabilité cellulaire. Elle est utilisée pour évaluer l 'activité métabolique des mitochondries. Test Presto bleu: ce test colorimétrique est basé sur la réduction de la résazurine par des enzymes mitochondriale, mesurée à une longueur d’onde 570 nm.

4-ROUGE NEUTRE (Neutral Red) Le neutre rouge (NR) ou chlorure de 2-amino-3-méthyl-7-diméthyl amino phénazonium est un colorant vital hydrosoluble , utilisé dans certains tests de cytotoxicité. le RN permet de différencier les cellules vivantes des cellules mortes. Il permet l’étude de l’action des xénobiotiques sur l’arrangement des phospholipides des membranes et sur la perturbation des fonctions associées (récepteurs hormonaux, enzymes, perméases, canaux ). -Après sa diffusion à travers la membrane plasmique de cellules intactes, Le RN étant légèrement électropositif, il a tendance à former des liaisons électrostatiques avec les sites anioniques présents dans l’environnement lysosomal. -Le colorant est exclu des cellules mortes. Après le temps de contact avec les xénobiotiques, l’évaluation du taux d’incorporation du RN par les cellules viables se fait après fixation des cellules au formaldéhyde , puis extraction du RN avec un mélange acide acétique éthanol et quantification par spectrophotomètre à 540 nm. Le rouge neutre

5-le bleu trypan : est un colorant vital hydrophile utilisé couramment en culture cellulaire pour différencier les cellules mortes des cellules vivantes.. La coloration au bleu de trypan est une méthode de coloration des cellules mortes. -un colorant anionique du groupe des colorants azoïques ,un réactif chromophore de couleur bleu chargé négativement qui a tendance à pénétrer dans les cellules. Une fois dans la cellule, la molécule va être rejetée dans le milieu extérieur. Ce mécanisme d’exclusion nécessitant de l’énergie. soit de l’ATP. Ainsi, seulement les cellules vivantes expulseront la molécule et resteront incolores au microscope. Contrairement à cela, une cellule morte deviendra bleue. La viabilité cellulaire est calculée comme suit: % Viabilité cellulaire = [(cellules totales) – (cellules colorées en bleu) / cellules totales] x 100. 6- Coloration de May-Grunwald-Giemsa La coloration de May-Grunwald-Giemsa est réalisée sur des échantillons fixés au méthanol. Cette coloration permet d’identifier les cellules apoptotiques suivant les critères morphologiques suivant : condensation du noyau et de la chromatine, bourgeonnement de la membrane plasmique, réduction du volume cellulaire et formation de corps apoptotiques.

7-Les colorants cationiques, tels que l'iodure de propidium, le bromure d'éthidium ou la 7-actinomycine (7-AMD), ne pénètrent pas les cellules à la membrane intacte. Ils permettent donc de mettre en évidence les cellules mortes. Iodure de prodium , est un fluorochrome non perméant qui ne diffuse qu’au travers des membranes plasmiques perméabilisées et il ne colore que les acides nucléiques des cellules mortes ayant perdu leur intégrité membranaire (cellules mortes, ou en apoptose)ou ils s’intercale de manière non spécifique toutes les 4 à 5 paires de base d’ADN .Seules les cellules mortes présentent donc une fluorescence rouge (617 nm). Leur noyau est détectable soit par microscopie de fluorescence , soit par cytométrie en flux. Il permet ainsi de mettre en évidence, des cellules apoptotique perméabilisées, hypodiploïdes. Le diacétate de fluorescéine permet d'évaluer la perméabilité membranaire. Non chargé, il passe facilement la membrane plasmique (transport passif) et est clivé en fluorescéine par les estérases des cellules vivantes. Cette fluorescéine libre chargée positivement sort plus lentement que ne rentre son ester. Elle est donc retenue dans les cellules vivantes .

8-Le test de la lactate déshydrogénase LDH , qui est une enzyme cytosolique particulièrement stable qui catalyse la conversion du lactate en pyruvate avec production de NADH. Ce test est utilisé pour détecter les effets directs sur la membrane plasmique . -la présence de LDH dans le surnageant cellulaire indique des lésions au niveau de la membrane plasmique. Les cellules mortes suite à la destruction de leur membrane plasmique, libèrent une grande quantité de LDH. Le dosage de cette enzyme peut se faire de diverses façons. Il est possible de le réaliser par des mesures d’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques. Les informations fournies permettent d’étudier des phénomènes de cytotoxicité. Pr SLIMANI.M

La LDH oxyde le lactate en pyruvate, ce qui a pour effet de réduire le NAD+ en NADH/H+ qui se régénère en réduisant un sel de tétrazolium jaune en composé formazan rouge, détecté par mesure spectrophotométrique à 490 nm

2-Etude de la perméabilisation des membranes mitochondriales : Mesure de la chute du potentiel transmembranaire : Un des paramètres biochimiques prépondérant de l’évaluation de la mort cellulaire est la perméabilisation des membranes mitochondriales qui peut être mis en évidence par la chute du potentiel transmembranaire mitochondrial et qui est généralement quantifiée par fluorimétrie ou cytométrie en flux grâce à des fluorochromes sensibles au potentiel transmembranaire mitochondrial. -chute du potentiel transmembranaire par ouverture des pores de transition de la perméabilité (Mitochondrial Permeability Transition pores :MTP) de la membrane interne de la mitochondrie. Il en résulte une augmentation de la perméabilité aux molécules de PM inférieur ou égal à 1500Da, alors que dans les conditions normales la membrane interne de la mitochondrie est pratiquement imperméable aux petites protéines ce qui crée un gradient électrochimique. Les MTP jouent notamment un rôle déterminant dans l'induction de l'apoptose par les radicaux libres de l'oxygène. Ainsi, sous l'effet de stress oxydants, les mitochondries subissent une transition de perméabilité avec libération de Ca++, et sont le siège d'un gonflement important et d'un découplage de la respiration mitochondriale.

Mesure du potentiel membranaire mitochondrial par cytométrie en flux. Exemple : Mesure du potentiel membranaire mitochondrial par cytométrie en flux. Les cellules sont incubées en présence de DiOC6 (3, 3’-dihexiloxacarbocyanine iodide). Ce fluorochrome est un cation lipophile, sensible au voltage, qui s’accumule sélectivement dans les mitochondries lorsqu’il est utilisé à faible concentration. La fluorescence des cellules est lue par cytométrie en flux et les cellules mortes sont exclues par marquage à l’iodure de propidium. La fluorescence obtenue est proportionnelle au potentiel membranaire mitochondrial, plus ce dernier est élevé, plus la sonde va s’accumuler dans la mitochondrie . Pr SLIMANI.M

3-Méthodes de cytotoxicité basées sur l ’altération de la prolifération cellulaire Le paramètre le plus important pour analyser la prolifération cellulaire est la mesure de la synthèse d’ADN comme marqueur spécifique de la réplication de l’ADN .Des précurseurs marqués de l’ADN sont utilisés :3H-thymidine , la 5 bromo 2’ désoxyuridine(BrdU) ou la 5 éthyl 2’desoxyuridine (EdU), lors de la synthèse d’ADN, ces précurseurs sont incorporés à la place de la thymidine. -La bromodésoxyuridine (BrdU ) , est un nucléoside synthétique, analogue structurel de la thymidine, où le groupe méthyle en 5 est remplacé par un atome de brome. L’incorporation de la BrdU (5-bromo-2’-désoxyUridine) lors de la phase de réplication de l’ADN est un reflet de l’activité mitotique et renseigne donc sur la prolifération cellulaire. La détection du BrdU nécessite l’utilisation d’un anticorps anti –BrdU , et donc une étape préalable de dénaturation de l’ADN , pour permettre à l’anticorps d’interagir avec le BrdU. Ajout Iodure de Propidium pour l’analyse du cycle

-Le DAPI (4'-6-diaminido-2-phenylindole) est une molécule fluorescente capable de traverser les membranes intactes et de se lier fortement aux bases adénine (A) et thymine (T) de l'ADN. Quand le DAPI absorbe la lumière UV (350 nm), il émet une fluorescence bleue brillante (461 nm) , ce qui permet de détecter et quantifier l'ADN grâce à un microscope à fluorescence ou par cytométrie en flux. Structure chimique du DAPI L’iodure de propidium et le bromure d’éthidium sont les colorants les plus utilisés. Ces deux colorants sont des intercalants aussi bien des doubles brins d’ADN que d’ARN. Tous les deux sont excitables dans le bleu et émettent dans le rouge (615 nm).

-Le Hoechst ( 2’-(4’-éthoxyphényl)-5-(4-méthylpipérazine-1-yl)-2,5’-bis-1H- benzimidazole, trichlorhydrate trihydrate) est une molécule de type bis-benzimidazole ,utilisés pour marquer l'ADN et se lie préférentiellement aux bases A-T. Ces colorants Hoechst possèdent un groupe éthyle leur permettant de traverser plus librement les membranes cellulaires. Le Hoechst 33342 possède une structure plus lipophile et traverse plus facilement la membrane lipidique des cellules pour atteindre l’ ADN. Il pénètre donc aussi bien dans les cellules vivantes que dans les cellules fixées alors que le Hoechst 33258 ne peut pénétrer que dans les cellules ayant été fixées et perméabilisées au préalable. -Différences principales entre les colorants Hoechst et DAPI : les colorants Hoechst sont moins toxiques que le DAPI ;les colorants Hoechst possèdent un groupe éthyle leur permettant de traverser plus librement les membranes cellulaires.

3- GENOTOXICITE  :Test des comètes  Cette technique permet de mesurer les cassures induites directement par un agent génotoxique et indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages ou lors de processus secondaires de fragmentation de l'ADN (Apoptose). Les cellules incluses dans une couche de gel d' agarose déposée sur une lame de microscopie et lysées. Ainsi sous l'influence du champ électrique , l'ADN chargé négativement , sous l’influence du courant de migrations , va déplacer vers l’anode. Après coloration à l'acridine orange, les fragments d'ADN sont observés au microscope à fluorescence. Cette technique permis de détecter des lésions de l'ADN dose-dépendantes sous l'effet de l’agent toxique. Les cellules dont l'ADN est intact se présentent alors sous la forme d'une sphère avec des contours bien marqués «tête de la comète ». Inversement, si l'ADN est endommagé, les fragments vont migrer à côté du noyau et former une traînée, assimilable à la queue d'une comète : Test des comètes (Ostling and Johanson, 1984).

Cette technique fut ensuite optimisée par Singh et al Cette technique fut ensuite optimisée par Singh et al. en 1988  en pratiquant l'électrophorèse en milieu alcalin, à pH > 13 . L'électrophorèse, dans ce cas est réalisée dans des conditions fortement alcalines afin de relaxer et de détendre l'ADN superenroulé. Dans de telles conditions, le test permet de détecter les cassures simple-brin et les sites alcali-labiles. Il donne à cette variante du test des comètes le nom de « Single cell gel electrophoresis» (SCGE). - Les résultats du test comète peuvent être exprimés de plusieurs manières: la distance de migration de l’ADN, l'intensité de fluorescence de la tête et la queue de la comète ainsi que la distance entre le centre de gravité de chacune d'elle.

Tête queue Tête queue Noyau non endommagé Noyau peu endommagé Noyau très endommagé ( cellule normale ) ( très nombreux fragments ) Représentation schématique des comètes

4- Autres méthodes de cytotoxicité 4-1-Evaluation du Calcium cytosolique la quantification du calcium cytosolique qui apporte des éléments d’information sur les mécanismes précoces d’apparition de la cytotoxicité. La spectrofluorimétrie permet de mesurer, sur une population de cellules, la [Ca2+]i grâce à une sonde fluorescente sensible au calcium (sonde Indo-1). Cette sonde est utilisée sous la forme de son ester acétoxy-méthylique (Indo-1 AM), dont la partie ester lui permet de franchir facilement la double couche phospholipide membranaire .Une fois dans le cytoplasme les estérases présentes déestérifient la sonde qui est alors piégée dans la cellule . La forme acide ainsi libérée se lie aux ions calcium. La sonde Indo-1, excitée à 350 nm, présente deux émissions à 405 et à 480 nm, qui correspondent respectivement à la forme liée et à la forme libre, la proportion de sonde sous forme liée et sous forme libre est fonction de la concentration de calcium cytoplasmique et l’intensité de fluorescence croit lorsque la concentration en calcium augmente. La concentration intracellulaire en calcium libre peut être estimée en valeurs arbitraires à partir du rapport entre les mesures de fluorescence à405 et 480 nm.

D’autres sondes sont utilisées : l’arsenazo III , composé qui change de propriétés d’absorption en fonction de la concentration en ions Ca++ et le flura2, composé qui change de propriété de fluorescence en fonction de la concentration en ions Ca++. -le FURA-2/AM émet à une seule longueur d’onde: 510 nm , utilisée est sous forme acéto méthyl ester, ce groupement permet à la sonde de diffuser librement à travers la membrane plasmique. Cependant, sous cette forme, la sonde est insensible au calcium et il faut que ce groupement soit clivé par les estérases présentes dans le cytoplasme pour que la sonde puisse se lier au calcium . Le calcul du ratio de fluorescence émise à 510 nm suite à une excitation à 340 et 380 nm permet de déterminer les variations de concentrations intracellulaires en calcium en fonction du réactif ajouté

organites intracellulaires. Charge d'une cellule en sonde /AM. Le dérivé acétoxyméthylé (sonde AM) de la sonde, lipophile, qui pénètre dans les cellules est hydrolysé par les estérases intracellulaires en sonde hydrosoluble qui se trouve piégée dans la cellule.

4-2-Test au dihydrodichlorofluorescéine-diacétate (DCFH-DA) Le diacétate de dichlorodihydrofluorescéine 2’,7’ (H2DCFDA) , perméant aux cellules, est une forme chimiquement réduite de fluorescéine utilisée pour évaluer les radicaux libres oxygénés produits par la cellule ( neutrophiles et macrophages). La quantité de ROS produites est mesurée par technique de fluorescence en utilisant la 2’,7’- dichlorofluorescine-diacétate (DCFH-DA), une sonde non fluorescente. Après sa désacétylation (2’,7’ DCFH -DA ) par les estérases intracellulaires, ce composé est oxydé par les ROS et devient la dichlorofluorescéine (2’,7’ (DCF), caractérisée par sa fluorescente.  Mesure des ROS par fluorescence due à l’oxydation de la dichlorofluorescine (DCFH) en dichlorofluorescéine (DCF)

4-3-les méthodes basées sur la détermination quantitative de la charge cellulaire globale en ATP, excellent paramètre de viabilité et de croissance cellulaire( Biomarqueur métabolique pour la viabilité cellulaire). -Le taux d’ATP peut également être analysé et donne une indication sur les capacités énergétiques de la cellule et donc sa viabilité . Les cellules non viables perdent non seulement la capacité de synthétiser l’ATP , mais contiennent également des ATPases endogènes qui dégradent rapidement l’ATP existant. - Ce test est basé sur le dosage de la quantité d’ATP des cellules qui est proportionnelle au nombre des cellules vivantes. Les cellules traitées et lysées sont incubées en présence de l’enzyme luciférase et du substrat luciférine. La mono-oxydation de cette dernière par la luciférase, en présence d’ATP et d’oxygène moléculaire produit un signal lumineux proportionnel à la quantité d’ATP présentes dans les lysats cellulaires. Un luminomètre est utilisé pour mesurer l’intensité de lumière émise par la luciférase dans un échantillon. ATP + d-Luciferin + O2 →Oxyluciferin + AMP + Pyrophosphate + CO2+ photons (560nm)

Toxicité et pollution bactérienne Les aliments peuvent être vecteurs de bactéries capables de provoquer divers affections chez le consommateur.sur le plan de l’étiopathogénie , ces maladies se répartissent en : -infections (brucelloses , fièvres typhoides et shigelloses etc ) qui sont secondaires à l’ingestion d’un nombre relativement réduit de germes spécifiques Toxi infections : provoquées par l’absorption massive de bactéries et de substances toxiques , produits de leur métabolisme qui se sont multipliées dans l’aliment ( Salmonelles, E coli ) - intoxications , ou le seul agent étiologique est une toxine élaborée par des microorganismes ayant colonisé l’aliment Pr SLIMANI.M

Il existe deux grands types de toxines : Les toxines bactériennes sont des protéines sécrétées par les germes infectieux qui se développent dans l’ organisme et dont les effets sont pathogènes. Elles se lient aux gangliosides de la membrane plasmique et pénètrent dans les cellules Les toxines sont également plus ou moins immunogènes : elles sont capables d'induire une réponse immunitaire.. Il existe deux grands types de toxines : - les endotoxines, faisant partie de Lipopolysaccharide. les exotoxines protéiques Les mécanismes d'action des exotoxines Les exotoxines peuvent être classées en fonction de différents critères : Selon le tissu ou la cellule qu'elles altèrent: - les neurotoxines (toxine botulinique ou tétanique) agissent sur le tissu nerveux, - les entérotoxines (toxine cholérique, staphylococcique ...) agissent sur les entérocytes . Selon leur mécanisme d'action au niveau moléculaire: - les toxines désorganisant les membranes, - les toxines à activité ADP-ribosyltransférase, - les métallo-protéases, - les superantigènes. Pr SLIMANI.M

les toxines protéiques -Toxines destructrices de la matrice extracellulaire (collagénases, hyaluronidase…) -Toxines cytolytiques destructrices de la membrane cellulaire (= cytolysines) -Toxines cytotoxiques bloquant la synthèse des protéines (shigatoxine, exotoxine de Pseudomonas aeruginosa, toxine de Corynebacterium diphtheriae) -Toxines cytotoniques (et cytolytiques) qui dérégulent les échanges ioniques (toxine cholérique) -Toxines agissant sur les neurones (neurotoxines) -Toxines désorganisant le cytosquelette cellulaire Pr SLIMANI.M

Mode d'action de la toxine botulique : botulisme Clostridium botulinum est une bactérie : un bacille gram positif anaérobie, du genre Clostridium, responsable du botulisme. Les neurotoxines botuliques sont produites par différentes souches de Clostridium botulinum qui diffèrent par les propriétés antigéniques des toxines qu'elles produisent (A, B, C, D, E, F et G). La neurotoxine botulinique affecte les terminaisons nerveuses périphériques. Une fois la barrière intestinale traversée , elle est transportée dans le sang jusqu’aux jonctions neuro-musculaires. La toxine botulique possède une structure composée d’une chaine légère liée par un pont disulfure à une chaine lourde après leur liaison via leur chaine lourde aux gangliosides au niveau des membranes neuronales , sont internalisées par invagination de la membrane nerveuse terminale et encapsulation de la toxine dans la terminaison nerveuse (endocytose : vésicule ) .L’acidification de la vésicule de capture va provoquer un changement de conformation du domaine de translocation (N-Terminal) de la chaîne lourde , forme un pore dans la membrane de la vésicule, le pont disulfure est rompu et la chaîne légère de la neurotoxine passe à travers ce pore dans le dans le cytoplasme neuronal. Pr SLIMANI.M

Les chaines légères qui porte l'activité enzymatique de la molécule de toxine botulique , sont des métallo endopeptidses de zinc qui interagissent avec le complexe SNARE ( Soluble N-éthylmaléimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor) aux jonctions neuromusculaires, empêchant des vésicules de fusionner à la membrane pour libérer l’acétylcholine. Ces protéines SNARE comprennent la protéine 25 associée au synaptosome (SNAP-25) , la synaptobrévine et la syntaxine. Comme ces trois protéines interviennent dans le processus de fusion des vésicules synaptiques avec la membrane plasmique , leur clivage provoque l’inhibition de l’exocytose d’acétylcholine . Conséquence la fusion des vésicules avec la membrane est bloquée et donc le muscle ne se contracte pas. Pr SLIMANI.M

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toxines à activité ADP-ribosyltransférase : NAD+ Acide nicotinique + ADP-ribose ADP –ribose est transféré sur une molécule cible dépendant de la toxine impliquée. ADP-ribose [ADP ribosylation], processus enzymatique de liaison covalente d’un groupement ADP-ribosyl (provenant du nicotinamide adénine dinucléotide ,NAD) sur une protéine, exercé notamment par la toxine pertussique sur les sous-unités alpha des protéines Gi, et par la toxine cholérique sur les sous-unités alpha des protéines Gs , inactive et modifie la transmission du signal vers l’adényl-cyclase ou les phospholipases C qui produisent les messagers secondaires.

Exemples de toxines à activité ADP-ribosyltransférase - toxine pertussique : - la pertussique agit au niveau des protéines de la famille Gi , toxine responsable de la coqueluche , catalyse L’ADP ribosylation de la protéine Gi , cette toxine catalyse ADP ribosylation d’un résidu Cys particulier de Gi , cette réaction empêche Gi d’échanger son GDP lié pour du GTP et ainsi de pouvoir inhiber l’AC , inhibe irréversiblement l’activité de Gi. Mécanisme d’ADP ribosylation de la sous unité aplha Gi par la toxine pertussique la toxine Bordetella pertussis catalyse le transfert d’un groupe ADP-ribose du NAD sur un résidu de la sous unité α qui interagit ave le site nucléotide La protéine G. Pr SLIMANI.M

toxines cytotoniques : choléra : Toxine cholérique toxines cytotoniques : choléra : Les toxines cytotoniques perturbent les échanges ioniques et/ou d’eau. Vibrio cholerae  (le vibrion cholérique ) est une bactérie à gram négatif responsable chez l'Homme du choléra. La toxine cholérique est une protéine qui appartient à la famille des toxines du type A-B , constituée de 2 entités : le composant B est constituée de 5 sous-unités , porte le site de fixation de la toxine sur son récepteur membranaire (monosialoganglioside GM1) et le composant A comporte 2 sous-unités (A1 et A2) reliés par un pont disulfure , porteur de l'activité catalytique toxique de la molécule. La toxine cholérique exerce son activité toxique en se fixant, par l’intermédiaire de la sous-unité B, sur un récepteur membranaire spécifique ( GM1), à la surface de l’entérocyte. Cette fixation induit la translocation de la sous-unité enzymatique A de la toxine à travers la membrane apicale de l’entérocyte , l’hydrolyse des ponts dissulfure reliant les deux unités de A aboutit à la libération de la sous unité A1 sous sa forme activée. Pr SLIMANI.M

La sous-unité A1 catalyse l’hydrolyse du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) et le transfert de l’ADP-ribose vers un résidu spécifique d’arginine de la sous unité régulatrice Gs de l’adénylate cyclase qui est située à la face interne de la membrane plasmique. l’ADP-ribosylation de cette protéine régulatrice conduit à l’activation permanente de l’adenylate cyclase, et à la conversion non contrôlée de l’ATP en AMP c. L’augmentation du taux intracellulaire d’AMP . L’AMPc active une protéine kinase AMPc-dépendante, qui mène à la phosphorylation de la protéine, à la modification du transport ionique, une sécrétion importante de chlorure de sodium et, par osmose, d'eau en direction de la lumière intestinale et inhibition la réabsorption du Nacl par l’entérocyte, la diarrhée. Pr SLIMANI.M

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ÉVALUATION DES EFFETS D’UNE SUBSTANCE TOXIQUE L’évaluation de la toxicité s’appuie sur des études qualitatives(non mesurables) ou quantitatives(mesurables) adéquates. Il existe plusieurs types d’études qui nous permettent d’évaluer les effets d’un toxique : •les études épidémiologiques, qui comparent plusieurs groupes d’individus ou les études de cas ; •les études expérimentales in vivo, qui utilisent des animaux (ex. : rat et souris) •les études in vitro, effectuées sur des cultures de tissus ou des cellules ; •les études théoriques par modélisation (ex. :structure-activité). La modélisation moléculaire est une application des méthodes théoriques et des méthodes de calcul pour résoudre des problèmes impliquant la structure moléculaire et la réactivité chimique. Pr SLIMANI.M

ÉVALUATION DES EFFETS D’UNE SUBSTANCE TOXIQUE Dose tolérable: est une estimation de la dose qui peut être absorbée pendant toute la vie sans risque appréciable pour la santé. Elle peut avoir différentes valeurs selon la voie d’administration. Elle s'exprime en masse de substance absorbée par unité de masse corporelle. Cette dose tolérable peut être journalière (DJT),hebdomadaire (DHT) ou hebdomadaire provisoire (DHPT) Pour l’inhalation, on parle de Concentration Admissible dans l’air (CAA) Dose journalière admissible (DJA) : ou " acceptable daily intake"(ADI) : elle s'exprime en fonction du poids corporel (en mg.kg-1p.c. par jour) et représente la quantité totale qu'une personne pourrait ingérer quotidiennement durant sa vie entière sans effets nuisibles. Cette dose peut être extrapolée à partir des données animales , en appliquant la valeur de sécurité (le facteur 100),qui tient compte des différences de sensibilité entre les animaux et l'homme des variations inter individuelles existant au sein de l'espèce humaine Ce coefficient de sécurité est porté à 1.000 si l'on craint que la métabolisation chez l'humain soit différente. Pr SLIMANI.M

-Le LOEL(Lowest-Observed-Effect Level) ou la LOEC (Lowest-Observed-Effect Concentration) est la plus faible dose (ou concentration) d’une substance qui provoque des modifications distinctes de celles observées chez des animaux témoins. -Le LOAEL(Lowest-Observed-Adverse-Effect Level) ou la LOAEC (Lowest-Observed-Adverse-Effect Concentration) est la plus faible dose (ou concentration) d’une substance qui provoque des modifications distinctes de celles observées chez des animaux témoins. -Le NOEL(No-Observed-Effect Level) ou la NOEC (No-Observed-Effect Concentration) : comme la dose (ou la concentration) la plus élevée d’une substance qui ne provoque pas de modifications distinctes de celles observées chez les animaux témoins. -Le NOAEL(No-Observed-Adverse-Effect Level) ou la NOAEC (No-Observed-Adverse-Effect Concentration) est la dose (ou la concentration) la plus élevée d’une substance pour laquelle aucun effet toxique n’est observé. Pr SLIMANI.M

la Dose Effective 50 (DE50) : la quantité de substance (exprimée en masse de toxique par kg de poids corporel) qui en moyenne produit un effet (vomissement, tremblement, ...) sur la moitié de la population. -Dose minimale mortelle (DMM) : la dose minimale tuant , dans un délai déterminé , des animaux de race , de poids et d’âge déterminés Dose en mg Nombre d’animaux Survivants Morts Pourcentage de mortalité 0.0625 0.125 0.25 0.5 1 2 4 5 3 20 40 100 80 0.5 mg pourrait être considéré comme la DMM

DLmin. : dose de substance la plus faible causant la létalité ; Lorsque la substance administrée pénètre dans l'organisme par inhalation ( gazeux ou volatil) , la concentration létale 50 ( CL50) a pour unité le nombre de « parties par million » (ppm), c’est-à-dire le volume en cm3 de substance toxique par m3 d’air. Concentration Létale 50 (CL50). La concentration s'exprime par la formule : Va/(Va+Vd)*100 avec Va= volume de gaz toxique et Vd = volume d'air dans lequel il est situé. Ces concentrations sont exprimées en mg.m-3 ou (ppm). La Dose Létale 50 (DL50) : la quantité de substance (exprimée en masse de toxique par kg de poids corporel) qui produit la mort de la moitié de la population. DL01 : dose de substance causant la mort de 1 % de la population des animaux d'essai ; DL100 : dose de substance causant la mort de 100 % de la population des animaux d'essai ; DLmin. : dose de substance la plus faible causant la létalité ; DTmin. : dose de substance la plus faible causant un effet toxique. TL50 : temps létal 50, temps qui s'écoule entre le moment ou le xénobiotique commence à être absorbé et le moment où 50% des animaux meurent.

Intérêt de la DL50 Classification des produits chimiques selon leurs toxicités. Évaluation du danger en cas de surdosage. Programmation des études de toxicité subaiguë et chronique chez les animaux. Programmation des essais thérapeutiques chez l’homme. Contrôle de qualité de produits chimiques Index thérapeutique ou marge de sécurité qui est une valeur représentant le rapport entre la dose létale 50 et la dose efficace 50(dl50/de50). La détermination de la DL50permettra de situer la toxicité de l'extrait sur l'échelle de valeur de toxicité des substances chimiques proposé en 1980 par Hodge et Sterner . Plus le chiffre de la DL 50 est faible, plus la substance testée est toxique.

Principe et méthodes de la détermination de la DL 50 La méthode expérimentale consiste à administrer à des lots d’animaux des doses croissantes de la substance.Le pourcentage est ainsi représenté graphiquement en fonction du logarithme de la dose administré, on obtient ainsi une courbe en sigmoïde : c’est la courbe de Trévan -100% de mortalité pour une dose tuant tous les animaux du lot -courbe % de mortalité = f(dose) , courbe sigmoide Courbe sigmoide :présente deux courbures et un point d'inflexion, nécessite l'essai d'un assez grand nombre de doses. Pr SLIMANI.M

Méthode de Miller et Tainter -La méthode de calcul de la DL50 et de ses limites de confiance est celle décrite en 1944 par Miller et Tainter. Elle consiste à porter directement sur du papier log.probabicité , le pourcentage de mortalité ( Probit ) en fonction du log Arithmétique de la dose. Ce changement d'échelle par la transformation du pourcentage de mortalité en probits (ou probability unit ( table de transformation des pourcentages en probits ).Exemple : groupe Dose (mg/Kg) Log dose % mortalité Probits 1 25 1.4 3.04 2 50 1.7 40 4.75 3 75 1.88 70 5.52 4 100 90 6.28 5 150 2.18 97.5 6.96 Les pourcentages des animaux morts dans chaque groupe sont relevés et convertis en unités probits. La linéarisation de cette courbe semi logarithmique permet de déterminer la DL50 qui est l’abscisse du point correspondant à 50% de mortalité Pr SLIMANI.M

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Pour deux dilutions , elle se calcule de la façon suivante : Karber et Berhens (1935), La dose létale 50% (LD50) peut être déterminée à partir de la formule de Karber et Berhens (1935), tient compte du nombre d’animaux tués dans chaque dilution. Pour deux dilutions , elle se calcule de la façon suivante : DL 50 = DL100 – ∑ (ab)/n, DL50 : Dose létale 50% ; DL100 : Dose létale 100% ; b : moyenne de la somme des morts entre deux doses successives ; a : différence entre deux doses successives ; n : moyenne du nombre d'animaux utilisés par lot. Dilutions 10-2 10-3 10-4 10-5 -Nombre d’animaux inoculés -Animaux morts 10 8 6 2 Demi –somme des animaux morts (b) -Produits ab 9 10 (a) 90 7 70 4 40 Pr SLIMANI.M

-Méthode de Litchfield et Wilcoxon( Dupont, 1970 ) La méthode de Litchfield et Wilcoxon permet, grâce à l’utilisation d’un test de signification statistique, test X2 de Pearson, de tracer la droite de régression probit en fonction du log de la concentration : une méthode semi graphique -Permet de déterminer , les valeurs: DL50 , intervalle de confiance sur la DL50 et le facteur de correction . Les relations quantitatives structure activité (QSAR ) : Quantitative structure - activity relationship) Les QSAR ) est le procédé par lequel une structure chimique est corrélée avec un effet bien déterminé comme l'activité biologique ou la réactivité chimique. Ce sont des méthodes statistiques capables de prédire les effets biologiques d’une variation de la structure moléculaire provoquée par un produit toxique, en fonction de ses propriétés physico-chimiques. Les molécules sont des assemblages d’atomes liés entre eux par des liaisons chimiques et dont les possibilités d’agencement sont infinies. C’est cet agencement et les atomes qui la constituent qui vont conférer à la molécule ses propriétés intrinsèques. Ces relations sont construites à l’aide de logiciels utilisant des méthodes mathématiques permettant l’analyse de données expérimentales d’un échantillon de molécules. Pr SLIMANI.M

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