Réparer ou modifier le génome des êtres vivants : l'immunité bactérienne au service des biotechnologies Christine Pourcel 5 octobre 2017

Cycle « D’une génération à l’autre » Sexe, environnement et procréation : la reproduction humaine. De la première cellule humaine aux organes de l'embryon. Contrôle épigénétique de l'expression des gènes chez l'homme : comment ça marche ?

Du génie génétique à CRISPR-Cas Vaccin recombinant contre le virus de l’hépatite B 1980 Souris transgéniques pour le virus de l’hépatite B 1985 La xénotransplantation et la maladie des agglutinines froides Les bactéries et les bactériophages Le système CRISPR-Cas 2005 1975

Plan Évolution naturelle des génomes Les premiers outils moléculaires Le système CRISPR-Cas CRISPR-Cas9: modification ciblée du génome Éthique

Le génome L’information génétique des êtres vivants est portée par leur génome ou chromosome(s). Les mutations peuvent altérer le code génétique et conduire à la production d’une protéine non-fonctionnelle. Des mutations apparaissent au cours de la vie et certaines peuvent causer un développement anormal des cellules et un cancer. Les mutations qui se produisent dans les cellules germinales, ovocytes ou spermatozoïdes, sont transmises à l’embryon.

L’évolution Les mutations sont constitutives de l’évolution des êtres vivants. La sélection naturelle permet l’élimination des organismes non viables et l’émergence de variants mieux adaptés à un moment donné à leur environnement. L’homme a forcé la sélection en effectuant des croisements de plantes ou d’animaux afin de rassembler des caractéristiques avantageuses chez des hybrides (XIXème siècle). Chez les plantes, des mutations ont été produites, au hasard, par l’utilisation de substances chimiques.

Les outils de biologie moléculaire pour la manipulation des génomes Les débuts du « génie génétique » Enzymes de restriction bactériennes (1965) Ligase du phage T4 *Première construction d’un plasmide recombinant en 1973 (Cohen et Boyer), *Production d’insuline de rat par une bactérie en 1978 (laboratoire de W. Gilbert) Origine: CURIOCITE

Virus vecteurs et transfection Adenovirus ou lentivirus pour transport d’ADN exogène Transfection: introduction de matériel génétique exogène dans une cellule eucaryote par ouverture transitoire de pores Expression transitoire ou stable (fin des années 70)

FIV chez l’animal et l’Homme La fécondation in vitro est effectuée chez le hamster et la souris dès 1968 Le premier « bébé-éprouvette », Louise Brown, est né le 25 juillet 1978 Dans les années 80 la procréation médicalement assistée se développe. Les techniques permettant le diagnostic préimplantatoire apparaissent Réaction PCR en 1986 (Kary Mullis Prix Nobel)

La transgénèse Premières souris transgéniques exprimant la b-globine de lapin en 1981 (Wagner et al.) Injection d’ADN Implantation dans une mère porteuse Naissance de souris portant le gène injecté Transmission à la descendance L’insertion du nouvel ADN se fait au hasard

Le clonage: reproduction à partir d’une cellule adulte Clonage à partir d’une lignée cellulaire « souche », puis à partir d’une cellule mammaire différenciée (Campbell et Wilmut, Brebis Dolly 1996) Crédits: Encyclopaedia Universalis

Agir de manière spécifique sur le génome humain Pourquoi? Réparer une anomalie génétique Ajouter ou améliorer une fonction Détruire des cellules dangereuses

La thérapie génique Illustration : A. Dagan pour le Journal du CNRS, d'après Catherine Caillaud

Outils de modification ciblée du génome (fin des années 80) Nucléases à doigt de zinc et TALEN (chimère entre domaine de fixation à l’ADN et enzyme FokI)

Applications Création d’animaux modifiés Thérapie génique Vaches sans cornes (Carlson et al. 2016) Miniporc (inactivation du récepteur de l’hormone de croissance) Thérapie génique Traitement de la leucémie aigüe lymphoblastique (LAL) CD19+ Qasim et al.2017: Molecular remission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR T cells Problème: coût élevé, faible efficacité

CRISPR-Cas une révolution technologique

CRISPR-Cas, un mécanisme de défense bactérien Les bactéries ont appris à se défendre contre leurs agresseurs: virus ou « bactériophages », plasmides, transposons, ADN étranger Immunité innée: les endonucléases, capables de détruire l’ADN envahissant (utilisées depuis longtemps pour la biologie moléculaire) Immunité acquise: système CRISPR-Cas

Premières découvertes: de 1987 à la fin des années 90 Découverte chez Escherichia coli d’une séquence constituée de la répétition de 5 régions conservées de 29 nucléotides séparées par des espaceurs de 32 nucléotides. CRISPR: « clustered regularly interspaced palindromic repeats » Des structures similaires sont observées dans d’autres bactéries et dans des archées. L’origine et la fonction des CRISPRs sont inconnues.

Le système CRISPR-Cas La structure répétée est souvent associée à un groupe de gènes appelés Cas (CRISPR-associated sequences) La structure répétée est transcrite en un grand ARN, découpé ensuite en petits ARN espaceurs Cas9 Cas2 Cas1 L preARN

2005: la nature des séquences espaceurs est identifiée Trois équipes montrent indépendamment que les séquences uniques proviennent en majorité de génomes viraux ou de plasmides Hypothèse : il s’agit d’un système immunitaire un fragment d’ADN étranger pénétrant dans la cellule est prélevé et ajouté à la structure CRISPR Lors de la prochaine arrivé du même génome, celui-ci est reconnu et détruit

2007 : la confirmation expérimentale R. Barrangou et col. montrent que chez Streptococcus thermophilus (bactérie du yaourt) l’ensemble CRISPR et gènes cas permet à la bactérie de résister à l’infection par des bactériophages Nécessaire à la destruction de la cible Nécessaire à l’acquisition de nouveau espaceurs

Les grandes étapes du fonctionnement du système CRISPR-CAS Adaptation Acquisition de nouveaux espaceurs Expression Transcription du locus CRISPR Interférence Inactivation de l’élément étranger

Classification des protéines Cas et histoire évolutive Les analyses de Eugene Koonin et Kira Makarova permettent de décrire 6 types (I à VI) et 33 sous-types de systèmes CRISPR-Cas. Classe 1: un groupe de protéines effectue la fonction d’interférence Classe 2: Une seule protéine effectue La fonction d’interférence Makarova et al. 2015 16/09/2018

2012: utilisation de la protéine Cas9 E. Charpentier et J. Doudna montrent que la protéine Cas9 est guidée par une molécule d’ARN dite TracRNA ou « ARN traceur » vers une séquence précise d’un génome afin de le couper. Après coupure on peut obtenir : -une mutation -une réparation avec ADN donneur -l’insertion d’un fragment d’ADN CNRS Le Journal

Les applications de la technique Fonctionne dans tous les types cellulaires, microbiens, animaux et végétaux Une cellule souche modifiée peut être utilisée pour créer un être vivant modifié: clonage Un vecteur viral (type adénovirus) peut transporter les gènes codant pour Cas9 et l’ARN traceur jusqu’à une cellule cible : thérapie génique, traitement de cancer, lutte contre des infections

La technologie est immédiatement reprise par de nombreux laboratoires En quelques années des dizaines de travaux sont réalisés par des centres de recherche académique et par des compagnies, dans le monde entier. En 2014 naissent en Chine deux singes dont le génome a été modifié. La même année une maladie génétique du foie, puis une myopathie sont corrigées chez la souris.

La technique peut être adaptée pour inactiver, marquer, modifier l’expression d’un gène.

Problèmes techniques liés à l’utilisation de CRISPR-Cas Coupures non–spécifiques à d’autres endroits du génome (effet hors-cible) Modification de l’épissage (Haiwei Mou et Jordan Smith, de l’université du Massachusetts, à Worcester, aux États-Unis)

Correction d’une maladie génétique Dec 2016 Nelson et al. Science Muscle cardiaque de souris, chez un animal sain (à gauche), chez une souris atteinte de myopathie (au centre), et chez une souris malade mais dont le gène défectueux (dystrophine DMD, Dystrophie musculaire de Duchenne) a été édité par CRISPR-Cas9 (à droite).

Immunothérapie contre certains cancers Lymphocyte T programmé pour attaquer une cellule cancéreuse

Modification de races animales Vache résistante à la tuberculose : insertion du gène NRAMP1 (natural resistance-associated macrophage protein-1) Gao et al. 2016, Genome Biology Chien Beagle avec masse musculaire augmentée (délétion du gène de la myostatine) Lai and Gao Xiang, Guangzhou, Chine

L’amélioration des plantes Riz, coton, maïs, tomates etc.. Zachari Lippman OGM ou non?

Le forçage génétique Créer des anophèles avec un gène récessif de stérilité, et les introduire dans la nature, ce qui entraînerait la disparition de l’espèce en quelques générations… et du paludisme. Supprimer la capacité de produire un poison chez le crapaud buffle Etc… Genetic Engineering & Biotechnology News

Autres applications Humaniser un animal pour la xénotransplantion Sauver des espèces en danger d’extinction en augmentant le nombre de femelles Ressusciter un être vivant (Mammouth)

Modifier l’embryon humain Dans de nombreux pays la manipulation des embryons humains est interdite (convention d’Oviedo ratifiée par la France en 2011) Le diagnostic préimplantatoire permet de limiter la transmission d ’anomalies génétiques connues (embryons conçus par FIV) Peut-on imaginer des cas particuliers pour lesquels on autoriserait la modification d’un embryon? Maladies génétiques Peut-on modifier les cellules germinales (Church, spermatozoïdes) ?

2015: essai de correction de la bêta thalassémie (HBB) dans l’embryon humain (équipe chinoise) 7 embryons sur 86 avaient un gène réparé La Recherche 2016

2017: correction du gène MYBPC3(collaboration d’équipes américaine, chinoise et coréenne) Les chercheurs ont introduit le sperme porteur du gène défectueux et CRISPR-Cas9 en même temps dans des ovocytes sains. Le gène a été réparé dans la majorité des cas en utilisant le « modèle » du gène sain de l’ovocyte et non l’ADN synthétique intégré avec CRISPR-Cas9. Au final, sur 58 embryons testés, 42 n’étaient plus porteurs de la cardiomyopathie hypertrophique. Pas d’effet hors-cible détectable. La Croix Aout 2017

Éthique et sécurité En mars 2015 des scientifiques appellent à un moratoire sur la modification de la lignée germinale humaine: atteinte à la dignité humaine eugénisme En France: Débat public avec un parlementaire, MR Jean-Yves Le Déaut, et une sénatrice, Mme Catherine Procaccia, sur la modification des génomes, Les enjeux économiques, environnementaux, sanitaires et éthiques des biotechnologies à la lumière des nouvelles pistes de recherche Conseil national consultatif pour la biosécurité (CNCB) 

Biohackers (backers) Pour moins de 1000 dollars, un biohacker peut constituer son laboratoire chez lui et effectuer des expériences simples avec CRISPR-Cas: DIY (do it yourself) Kits modification de bactéries, levures, plantes

Débats publics et forums https://www.youtube.com/user/FEBioethique/videos

Bibliographie Rapport parlementaire 14 avril 2017. Les enjeux économiques, environnementaux, sanitaires et éthiques des biotechnologies à la lumière des nouvelles pistes de recherche, par Jean-Yves Le Déaut et Catherine Procaccia. Magazines scientifiques CRISPR-Cas9 l’outil qui révolutionne la génétique par Emmanuelle Charpentier et Pierre Kaldy, Pour la Science N°456, Octobre 2015 Bricoleurs du vivant par Elsa Abdoun, Emilie Rauscher, Yves Sciama, Caroline Tourbe, Science et Vie, Janvier 2016 La trop facile manipulation du génome par Mathias Germain, La Recherche N°507, Janvier 2016 Revues scientifiques en anglais Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Par Rodolphe Barrangou et Jennifer Doudna, 2016 Nature Biotechnology 34: 933-941 The societal opportunities and challenges of genome editing, 2015 Genome Biology 16: 242 CRISPR-Cas: biology, mechanisms and relevance. Par Frank Hille et Emmanuelle Charpentier, 2016 Phil. Trans. R. Soc B 371:2050496