Culture de cellules et de tissus Page 43 - 52 Culture cellulaire Cultures de tissus végétaux Cultures de tissus animaux

Culture de cellules et de tissus Page 43 - 52 Culture cellulaire Cultures de tissus végétaux Cultures de tissus animaux

Culture de cellules et de tissus Page 43 - 52 XXe siècle : culture de tissus Perfectionnement de la technique 1950: Culture de cellules Trypsinisation (trypsine)

Culture de cellules et de tissus Page 43 Culture de tissus ? Le terme général englobant le prélèvement de cellules, tissus ou organes d’un animal ou d’une plante et leur placement ultérieur dans un environnement artificiel (in vitro) conduisant à leur croissance (mitoses)

Culture cellulaire Définition: Page 43 Définition: Le maintien en dehors de l’organisme (in vitro), des cellules non organisées en tissu mais capable de se diviser et d’exprimer des métabolismes et des fonctions spécifiques.

Techniques d’obtention Culture cellulaire Pages 43 - 44 2 types de cellules: Libres et circulantes (¢ sanguines) Prélèvement et centrifugation En cohésion entre elles (tissu) Explants ou digestion enzymatique Techniques d’obtention Avantages et inconvénients

Culture cellulaire Les méthodes de culture: Page 44 Les méthodes de culture: Culture stationnaire ou monocouche Affinité des ¢ au support (plastique ou verre) ↑ Rendement Culture en suspension

Culture cellulaire Contrôler la fonctionnalité: La prolifération ¢ Page 44 Contrôler la fonctionnalité: La prolifération ¢ Préservation des fonctions spécialisées

Culture cellulaire Evolution in vitro: La prolifération ¢ Page 44 Evolution in vitro: La prolifération ¢ Préservation des fonctions spécialisées Ok mais elle peut ralentir Modification et disparition (dédifférenciation)

Culture de cellules et de tissus Page 43 - 52 Culture cellulaire Cultures de tissus végétaux Cultures de tissus animaux

Culture de tissus végétaux Page 45 In vitro Cultures d’explants de plantes - milieu synthétique - conditions stériles - environnement contrôlé - espace réduit = matériel végétal de base qui servira à produire un clone - morceau de feuille - morceau de tige - un bourgeon - … ¢ végétales

Culture de tissus végétaux Page 45 In vitro ? Cultures d’explants de plantes ? = matériel végétal de base qui servira à produire un clone - morceau de feuille - morceau de tige - un bourgeon - … ¢ végétales

Culture de tissus végétaux Page 45 Les cellules végétales - Totipotentes ¢ végétales différenciées → indifférenciées → se divisent activement → se différencient → ¢ différentes Toutes les ¢ végétales sont capables d’exprimer toutes les informations génétiques contenues dans l’ADN. ≠ ¢ animales

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Etape 1: Prélèvement de cellules isolées ou de tissus dans une feuille ou un autre organe.

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Etape 2: Le prélèvement est déposé sur un substrat nutritif → maintien en vie = tissu biologique c ¢ indifférenciées → zone de croissance

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Etape 3: Stérilisation de la surface du tissu prélevé Etape 4: Fragments de tissu déposés sur un milieu nutritif solidifié avec de l’agar-agar

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Si le tissu est dépourvu de chloroplastes (= hétérotrophe) Le milieu doit contenir - Sels minéraux - Sucre (saccharose ou glucose)

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Hormones végétales = phytohormones - Auxines - Cytokinines Mitoses

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique = masse cellulaire c amas de ¢ indifférenciées

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Etape 5: Le cal est mis en suspension (milieu liquide) → dissociation des ¢ calleuses

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Etape 6: Filtration à travers une gaze→ ¢ calleuses

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Etape 7: ¢ calleuses → culture

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Etape 8: ¢ calleuses → culture → masse cellulaire

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Etape 9: ¢ calleuses → culture → masse cellulaire → cal

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Etape 10: Clonage des ¢ calleuses → ↑ rendement Le clonage est d’abord une stratégie de reproduction naturelle (fraisier; pomme de terre; jonquilles…)

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Etape 11: Variation et combinaison [phytohormones] → formation organes.

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Etape 12: Formation de tiges

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Etape 13: Les plantules présentent des radicelles (petites racines) et des petites feuilles.

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Etape 14: Transplantation des plantules dans des pots

Culture de tissus végétaux Pages 45 - 46 Technique Etape 15: Développement → plante mature

Culture de tissus végétaux Cellule végétale: = protection → barrière aux échanges d’information génétique

Culture de tissus végétaux Page 46 Tissu végétal: Comment peut-on séparer les cellules d’un tissu végétal ? Enzymes : pectinases et cellulases (champignons) → protoplastes = ¢ sphériques sans paroi

Culture de tissus végétaux Page 46 Protoplastes: Agents stabilisants Utilisation expérimentale comme les ¢ animales Transfert direct de gènes (PEG; électroporation; microinjection)

Culture de tissus végétaux Page 44 Protoplastes: Conditions favorables 1.- Reconstitution de la paroi pectocellulosique 2.- Réarrangement des organites 3.- Divisions cellulaires → microcolonies → cals

Culture de tissus végétaux Page 46 Pas chez toutes les espèces végétales Cals Plantules Milieu de régénération Embryons somatiques

Culture de tissus végétaux Page 46 Protoplastes: Toutes les espèces végétales Régénération de plantules → toutes les espèces Monocotylédones (céréales) Dicotylédones

Culture de tissus végétaux Page 46 Cotylédon(s) = feuille(s) primordiale(s) constitutive(s) de la graine.

Culture de tissus végétaux Page 46 Protoplastes: Toutes les espèces végétales Régénération de plantules → toutes les espèces Monocotylédones (céréales) Dicotylédones NON OK

Culture de tissus végétaux Pages 46 - 49 Utilisations des protoplastes: L’hybridation somatique La transformation génétique

Culture de tissus végétaux Pages 46 - 49 Utilisations des protoplastes: L’hybridation somatique La transformation génétique

Culture de tissus végétaux Pages 46-47 L’hybridation somatique: = fusion des protoplastes (noyaux et cytoplasmes) - où ? - avantage ? - but ? Milieu approprié Surmonter barrières de la reproduction sexuée → espèces différentes (genre) Créer de nouvelles combinaisons ↑ productivité

L’hybridation somatique Page 47 Exemples de genres utilisés: Petunia Daucus Carotte Solanum Pomme de terre, tomate, aubergine… Croiser des espèces → combiner plusieurs qualités - résistances - fixation d’azote atmosphérique → ↑ productivité

L’hybridation somatique Page 47 Première expérience (1978) But: Solanum Tomate x pomme de terre = pomate → stérile tomates cultivables à basse température

L’hybridation somatique Page 47 Technique (tabac): Centrifugation Sélection des hybrides

L’hybridation somatique Page 47 Autres expériences: Solanum tuverosum = Pomme de terre cultivée - Introduction de gènes de résistance - à certains virus - au mildiou - à la pourriture bactérienne X Solanum brevidens (A. Sud)

L’hybridation somatique Page 47 Autres expériences: Stérilisation mâle chez le colza et résistance à l’atrazine (herbicide)

L’hybridation somatique Page 48 Comment peut-on faire fusionner les protoplastes (anions) ? Agents chimiques: 1.- Ca2+ et pH élevé → neutralisation charge électrique 2.- PEG → agrégation des ¢ + déstabilisation m.p → fusion Electrofusion: Champs électriques intenses de courte durée → déstabilisation m.p. → fusion + + +

L’hybridation somatique Page 48

L’hybridation somatique Pages 48 - 49 Tous les échanges sont possibles: Fusion des noyaux et des cytoplasmes Fusion des cytoplasmes

L’hybridation somatique Pages 48 - 49 Tous les échanges sont possibles: Fusion des noyaux et des cytoplasmes Fusion des cytoplasmes

Fusion noyaux et cytoplasmes Page 48 Fusion noyaux: Recombinaison + ou – importante entre chromosomes parentaux → transfert de gènes nucléaires Si recombinaison + + + → stérilité (pomate) Si recombinaison + → quelques fragments (asymétrique)

Fusion noyaux et cytoplasmes Page 48 Fusion noyaux: Recombinaison + ou – importante entre chromosomes parentaux → transfert de gènes nucléaires Si recombinaison + + + → stérilité (pomate) Si recombinaison + → quelques fragments (asymétrique) Comment favoriser le transfert partiel ? En déstabilisant par irradiation l’ADN du donneur avant la fusion.

Fusion noyaux et cytoplasmes Page 48

L’hybridation somatique Page 48 Tous les échanges sont possibles: Fusion des noyaux et des cytoplasmes Fusion des cytoplasmes

ADN mitochondriale et chloroplastique Fusion cytoplasmes Page 48 = les cybrides: Fusion des noyaux → 1 noyau après mitoses + cytoplasme recombiné Mitochondries Recombinaison Chloroplastes Recombinaison, 1 seul type ADN mitochondriale et chloroplastique Modifications des relations nucléo-cytoplasmiques

Fusion cytoplasmes Obtention provoquée des cybrides: Pages 48-49 Obtention provoquée des cybrides: Irradiations létales → ¢ du parent donneur → inactivation du noyau → transfert des mitochondries et des chloroplastes uniquement

Fusion cytoplasmes Obtention provoquée des cybrides: Page 49 Obtention provoquée des cybrides: En plus, traitement à l’iodo-acétate → ¢ du parent receveur → inactivation des organites → transfert du noyau uniquement Cybrides c noyau (receveur) + organites (donneur)

Les hybrides retenus Page 49

Culture de tissus végétaux Page 49 Applications des protoplastes: L’hybridation somatique La transformation génétique = transfert direct d’ADN dans les ¢

Culture de cellules et de tissus Pages 50 - 52 Culture cellulaire Cultures de tissus végétaux Cultures de tissus animaux

Culture de cellules Culture primaire Culture secondaire Page 50 Culture primaire ¢ proviennent directement d’un tissu ou d’un organe Culture secondaire ¢ proviennent de la culture primaire ( ↑densité)

Obtention de ¢ hybrides Pages 50-51 = ¢ à deux noyaux Etudier les interactions entre les constituants cellulaires provenant de cellules différentes ¢ animale x ¢ tumorale → perte de chromosome humain → observer perturbations → attribuer un gène à un chromosome

Culture de cellules Page 51 Fusion cellulaire → cellules hybrides (2 parents différents) 1975: création de ¢ capables de produire des anticorps monoclonaux = anticorps issus d’un seul clone de plasmocytes, reconnaissant qu’un seul type d’épitope sur un antigène donné, donc très spécifique.

Anticorps monoclonaux Page 51

Anticorps monoclonaux Page 51 Fusion cellulaire: ¢ de myélome x un lymphocyte B hybridome Un type de cellule cancéreuse possédant la machinerie pour fabriquer des anticorps

Anticorps monoclonaux Page 51 Hybridome: → lignée cellulaire immortelle

Anticorps monoclonaux Page 51

Sélection des hybridomes Page 52 Après la fusion 3 sortes de ¢: Les ¢ de myélome non fusionnées ou fusionnées entre elles. Les plasmocytes non fusionnés ou fusionnés entre eux. Les hybridomes.

Sélection des hybridomes Page 52 Sur un milieu de culture spécifique (HAT) (HAT = Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine) Les ¢ de myélome utilisées sont des ¢ qui, par sélection génétique, ont perdu la faculté de produire une enzyme impliquée dans la synthèse de nucléotides. Enzyme, la ¢ ne peut pas vivre dans ce milieu.

Sélection des hybridomes Page 52 Donc Les ¢ de myélome non fusionnées ou fusionnées entre elles meurent. Les plasmocytes non fusionnés ou fusionnés entre eux meurent après qqs jours Les hybridomes survivent.

Sélection des anticorps monoclonaux Page 52 1.- On isole au hasard qqs hybridomes → culture séparée

Sélection des anticorps monoclonaux Page 52 2.- Les ¢ se divisent durant qqs jours → clone d’hybridomes → un type d’anticorps monoclonaux 3.- Les anticorps se trouvent dans le surnageant 4.- Vérifier compatibilité des anticorps avec l’antigène.

Anticorps monoclonaux Pages 50 / 52 Réaction immunitaire humaine Solution ?

Anticorps chimériques « humanisés » Comment ? Anticorps de souris

Anticorps chimériques « humanisés » Page 52 Modifications génétiques (1984) C de souris → C humaines V de souris Réponse immunitaire humaine

↓ Réponse immunitaire humaine Anticorps humanisés Page 52 Modifications génétiques (1990) Région hypervariables de la souris → contact étroit avec l’antigène ↓ Réponse immunitaire humaine ↓ affinité

Application des anticorps monoclonaux Page 52 Outils de diagnostic Thérapeutiques

Application des anticorps monoclonaux Page 52 Outils de diagnostic Thérapeutiques

Application des anticorps monoclonaux Page 52 Outils de diagnostic Détecter la présence de virus (hépatite B, herpés, SIDA) Détecter la présence de bactéries Détecter la présence de ¢ tumorales

Application des anticorps monoclonaux Page 52 Outils de diagnostic Thérapeutiques

Application des anticorps monoclonaux Page 52 Thérapeutiques On conjugue les anticorps avec Isotope radioactif → irradiation ciblée des ¢ tumorales en épargnant les tissus sains. Toxine → pour cibler et détruire des ¢ cancéreuses Bloquer un agent infectieux (récepteur cellulaire)