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Gène rapporteur Un gène rapporteur est un gène témoin, un marqueur codant pour une protéine d’activité connue et détectable, il est utilisé pour étudier l’activité d’un autre gène. Ainsi le gène rapporteur est rajouté à un gène d'intérêt dans une construction génétique afin de visualiser la protéine recombinante produite. Les gènes rapporteurs peuvent être des gènes codant des protéines fluorescentes ou des enzymes dont l'action provoquera l'apparition d'un produit coloré. -exemple de protéines fluorescentes: la protéine fluorescente verte (GFP), la luciférase qui émet une lumière jaune. -exemple de protéine à activité enzymatique: le gène GUS, codant une enzyme (la bêta- glucuronidase) qui colore en bleu les cellules où il est actif, mais il est létal. Le gène lac Z codant la ß-galactosidase (Lac Z) qui métabolise le X-gal fait apparaître une coloration bleue. -Les variants spectraux de la GFP obtenus par modification génétique de la GFP sont la ECFP (enhanced cyan fluorescent protein) ou la EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) ont des propriétés identiques à la GFP. La DsRed de l’anémone de mer est aussi obtenue par modification génétique, elle émet une fluorescence rouge.

Gènes marqueurs doivent obéir à 3 conditions -être étrangers au génome de l'organisme modifié afin que leur produit n'intervienne pas dans le métabolisme. -leur produit doit permettre une visualisation rapide et précise afin de déterminer dans quel tissu agit le gène modifié (précipitation du produit dans son site de production exp transformation du X-glu par l’enzyme GUS donnant un produit bleu dans le site). - - leur produit doit être quantifiable afin de mesurer l'activité du promoteur induisant la modification.

Définition d’un gène rapporteur: Dont l’expression est proportionnelle à la protéine d’intérêt Gène marqueur Protéine Activité connue Détectable

Caractéristique d’un gène rapporteur: Gène rapporteur Le produit ne s’exprime pas dans la cellule concernée Expression est facilement quantifiable Mis sous la dépendance d’un promoteur

Type de gène rapporteur Gène rapporteur Protéine à activité enzymatique lac z CAT Chloramphénicol acetyl transférase Protéine fluorescente GFP luciférase

Gene de la béta glucuronidase L'abréviation GUS réfère au gène de la β-glucuronidase, qui provient de E.coli. Le substrat de GUS est le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-Glucuronic acid (X-Gluc). Le clivage de ce dernier sous l'action du GUS produit un précipité bleu et insoluble qui confère une coloration bleue.

La visualisation de l'activité enzymatique codée par le gène LacZ requiert la fixation préalable des tissus et ne peut donc pas être employé pour marquer des cellules vivantes. Aussi, l'existence d'activité béta- galactosidase endogène chez bon nombre de plantes fait que cette méthode est peu usitée. Pour pouvoir métaboliser le X-gal, la cellule doit être exposée à un inducteur, l'isopropyl béta-D-1- thiogalactopyranoside (IPTG), proche du lactose.

Gène codant pour la GFP (green fluorescent protein) de la méduse Aequora victoria La GFP est une protéine de 27 kDa avec 2 sous-unités constituées de 1 tonneau (11 feuillet béta) entourant une hélice alpha porteuse d'un chromophore). Actuellement, la technique de microscopie de fluorescence utilisant des marqueurs GFP fait partie des méthodes les plus couramment utilisées en imagerie biologique. La molécule fluorescente a la capacité d'adsorber de l'énergie lumineuse dite lumière d'excitation et de la restituer rapidement sous forme de lumière fluorescente ou lumière émise. L'émission de la lumière cesse dès l'arrêt de l'excitation. Contrairement au gène LacZ, la visualisation de la GFP n'exige pas la fixation du tissu et ne nécessite pas de substrat chromogène. Il suffit de la soumettre à une radiation bleue ou UV pour observer une brillance verte. En plus, la GFP ne nécessite pas la destruction de l'échantillon étudié, ce qui permet notamment de faire une étude des variations de son expression au sein des mêmes tissus au cours du temps. Ce gène rapporteur, est donc particulièrement adapté pour suivre l'expression d'un transgène dans des cellules vivantes

12  Le promoteur est une courte séquence spécifique d’ADN, située au début des gènes, sur laquelle se fixe l’enzyme qui effectue la transcription (l’ARN polymérase).  Etant nécessaire pour que la transcription débute, le promoteur est indispensable au fonctionnement d’un gène.  Il permet d’une part de positionner tous les éléments protéiques nucléaires nécessaires à l'initiation de la transcription. Alors comment étudier la fonctionnalité du promoteur ?

13 Structure d'un promoteur chez les procaryotes/eucaryotes 1- chez les procaryotes :

14 2-Chez les eucaryotes :

15 l’études d’un promoteur à l’aide d’un vecteur  On appelle vecteur l’ADN dans lequel on insère le fragment d’ADN à étudier.  L’ADN inséré est appelé ADN étranger ou ADN exogène.  Cette séquence nucléotidique est capable de s’auto-répliquer.  Les vecteurs sont donc des petits ADN dans lesquels on insère un fragment d’ADN que l’on veut étudier.  Ces petits ADN sont généralement des plasmides ou des bactériophages ( plasmides ; cosmides ; BAC ; PAC ; YAC).

16 Le promoteur – gène rapporteur à insérer dans le plasmide vecteur Le promoteur est recombéné avec le vecteur Le fragment d’ADN sont découpé dans les régions promotrice (- 1150/-313) et assemblé par plusieurs réaction enzymatique Le clonage d’un promoteur-gène rapporteur dans un vecteur Promoteur à étudier Gène rapporteur Cohérence avec ADN légase

17 Promoteur vecteur activité promotrice Ce plasmide est transfecté dans les cellules( bactérie)

18 1) Délétion graduelle à partir de 5’ 2) Délétion de zone PΔ5 3) Mutation C-618A (site AP2) L’étude de la fonctionnalité du promoteur par: Promoteur modifié

19 Analyse par délétion partielle de promoteur

C-618A5’ /-313 PΔ /-313