Quantification sanguine du cytomégalovirus humain XIXème Colloque de Virologie de Versailles Alexandra Ducancelle Département des Agents Infectieux CHU Angers

Le cytomégalovirus Famille des Herpesviridae Virus ubiquitaire 1ère cause des infections virales congénitales Infections sévères chez les patients immunodéprimés –Receveur d’allogreffe –Patient infecté par le VIH Particule virale en ME

Physiopathologie Primo-infectionVirémie Diffusion Organes cibles Latence Réinfection Endogène: Réactivation Immunodépression Stimulation allogénique Réinfection exogène Excrétion virale intermittente

Physiopathologie Réplication virale du CMV –Processus dynamique in vivo Temps de doublement de la population virale in vivo = 1 jour –Apparition des marqueurs d’infection active : antigénémie, virémie, ADNémie, ARNémie Emery et al (1999) J Exp Med 190: Sia et al (2000) J Infect Dis 181: Humar et al (2002) J Infect Dis 186: Razonable et al (2003) J Infect Dis 187:1801-8

Physiopathologie Chez les receveurs d’allogreffe Marqueurs d’infection active Conséquence clinique Infection à CMV Maladie à CMV Conséquence thérapeutique Initiation d’un traitement anticipé (dit préemptif)

Méthodes de quantification du CMV –Antigénémie pp65 Moléculaires –PCR conventionnelle : Amplicor Monitor ® (COBAS, Roche) –PCR temps réel : Techniques maison Trousses commercialisées (Argène Biosoft, Qiagen, Abbott….) –NASBA : Trousse Nuclisens pp67 ® test (Organon tecknika) Biomérieux –Hybridation moléculaire Hybrid Capture DNA Assay ® (Digene) MoléculairesNon moléculaires PCR = Polymerase chain reaction NASBA = Nucleic acid sequence-based amplification

Méthodes de quantification du CMV Méthodes moléculaires MéthodesDélai de résultat Seuil/ Cible viraleAvantagesInconvénients Amplicor CMV Monitor heures Cible : gène ADN polymérase virale Seuil de détection : 400 copies/ml de plasma ou 5x10 5 leucocytes Grande sensibilité Risque de contamination Linéarité de 400 à 1x10 5 copies Hybrid Capture DNA assay 6 heures700 copies/ml de sang 2,1 pg d’ADN Linéarité : 700 à 2x10 6 copies/ml de sang ou 830 pg d’ADN Pas de contamination Facilité d’utilisation sensibilité par rapport à l’agpp65 et PCR ? Nuclisens CMV pp molécules d’ARNNon quantitatif

Méthodes de quantification du CMV Méthodes moléculaires MéthodesPrélèvement /cible Seuil et amplitude de détection extractionamplification CMV R-gene kit ™ (argene) Kit 50 réactions Sang total Cible : gène UL83 codant la pp65 Seuil de détection : 1 copie/µl Standard : 2500 à 2,5 millions de copies Automatisée (biorobot, MagNAPure, Easy Mag) Manuelle Smart cycler ® LightCycler ® ABI PRISM ® RotorGene ® CMV RUO PCR Kit™ (Abbott ) Plasma Sérum Cible : gène UL83 Seuil de détection : 0,2 copies/µl (50 copies/ml) Standard : copies/µl Automatisée : m1000 (Abbott) Manuelle :QIAamp™ DNA Mini Kit (Qiagen), PureArt™ DNA Mini Kit (artus) ABI PRISM ® 7000, m1000 ®, Abbott artus™ (Qiagen) Kit réactions Sang total Cible : région 105pb Seuil de détection : 0,2 à 0,4 copies/µl Standard : copies/µl Automatisée (biorobot) Manuelle:QIAamp ™ DNA Mini Kit (Qiagen), LightCycler ® ABI PRISM ® artus 3000™ / Rotor-Gene™

INTERETS DE LA QUANTIFICATION

Intérêts de la quantification 2 questions se posent –Pourquoi quantifier ? –Par quelles méthodes ?

Indications de la quantification Rôle des marqueurs de réplication virale pour : –Distinguer infection active et infection latente –Identifier les patients à haut risque de développer une maladie à CMV –Dépister une infection active avant l’apparition de tout symptôme clinique –Diagnostiquer une maladie à CMV –Pour surveiller l’efficacité d’un traitement

Charge Virale (log genomes/ml) Probabilité maladie à CMV Cope et al (1997) J Infect Dis 176: Cinétique de réplication virale Charge virale CMV

Emery et al (2000) Lancet 355: Norris et al (2002) Transplantation 74: Razonable et al (2003) J Infect Dis 187: Cinétique de réplication virale Marqueurs de la réplication virale sont prédictifs d’un risque de maladie à CMV: –le niveau de la charge virale CMV après la greffe –la vitesse d’augmentation de la charge virale CMV entre deux prelèvements consécutifs

,00,0 0,20,2 0,40,4 0,60,6 0,80,8 1,01,0 1,21,2 1,41,4 1,61,6 Vitesse d’augmentation de la charge virale (log genomes/ml sang) Charge virale Initiale CMV (log genomes/ml sang) Cinétique de réplication virale Emery et al (2000) Lancet 355:

Cinétique de réplication virale Quantification de la charge virale CMV dans les leucocytes (PBL) chez 47 transplantés de cœur et foie par technique Cobas Amplicor Monitor Charge virale CMV log 10 copies/10 6 PBL (moy±SD) 1ère PCR positive Semaine 4Semaine 5Semaine 6 Patients symptomatiques (n=30) 3 (3±0,6) a 4 (3,7 ±0,6) b 4,3 (4,2 ±0,4) c 4,4 (4,4 ±O,3) d Patients asymptomatiques (n=17) 2,7 (2,7 ±0,4) a 2,8 (2,8 ±0,5) b 3,4 (3,2 ±0,6) c 3,6 (3,7± 0,3) d a : non significatif b : p< 0,0001; c : p = 0, 006; d : p<0,0001 V. Ghisetti et al. Journal of medical Virology (2004)

Intérêts de la quantification 2 questions se posent –Pourquoi quantifier? –Par quelles méthodes ? Valeur de l’agpp65 dans le diagnostic et la prédiction de la maladie à CMV Corrélation entre l’agpp65, la technique Cobas Amplicor et la PCR temps réel

Intérêts de la quantification Cohorte de 73 transplantés d’organe (35 foie, 26 rein, 12 cœur) –Détermination de l’agpp65 pendant les 6 premiers mois après la greffe (2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 14 et 16) – Objectifs : Sensibilité de l’antigénémie dans le diagnostic de la maladie à CMV et dans la prédiction de la maladie à CMV Bernabeu-Wittel et al, JID 2005

Intérêts de la quantification Valeur de l’agpp65 dans le diagnostic de la maladie à CMV Valeur de l’agpp65 dans la prédiction de la maladie à CMV SensibilitéSpécificitéVPPVPN Agpp65  10 pos/10 5 leucocytes 86%65%51%92% Bernabeu-Wittel et al, JID 2005 VPP: valeur prédictive positive VPN : valeur prédictive négative SensibilitéSpécificitéVPPVPN Agpp65  10 pos/10 5 leucocytes 46%73%42%76%

Intérêts de la quantification Valeur de l’agpp65 dans la prédiction de la maladie à CMV dans une cohorte de 30 transplantés rénaux Tests leucocytaires Agpp65bDNA (Bayer) Monitor Amplicor (Cobas Roche) Sensibilité (%) Spécificité (%) VPP (%)6150 VPN (%) Pellegrin et al., JID2000

Intérêts de la quantification Message –Antigénémie pp65 Méthode sensible pour le diagnostic de l’infection à CMV Valeur de l’antigénémie dans la détection précoce de la maladie à CMV (technique utilisée, seuil de positivité de l’antigénémie)

Intérêts de la quantification 32 transplantés de foie Surveillance bi-hebdomadaire pendant les 3 premiers après la greffe, puis tous les 15 jours jusqu’au 6ème mois Traitement anticipé si Agpp65 > 20 cellules positives / leucocytes  20 patients –Objectif : comparer les résultats de la quantification du CMV dans les leucocytes par trois méthodes : l’antigénémie, PCR conventionnelle (Amplicor Monitor), PCR temps réel (technologie TaqMan) Allice T, J Med virol 2006

Intérêts de la quantification Résultats de la quantification du CMV Allice T et al (2006) J Med Virol, 78: Agpp65 (nombre de cellules/ PBL) Cobas Amplicor (log copies/ PBL) Real time PCR (log copies/ PBL) valeurs médianes (moyenne± écart-type) Patients en traitement Anticipé (n=20) 98*(277 ±320)3,9** (3,9 ±0,2)3,8*** (3,5 ±1) Patients non Traités (n=12) 2* (5 ±6)3,1** (3,1 ±0,3) 2,9***(2,8 ±0,8) * p= 0,01, ** p< 0,0001, *** p< 0,0001

Intérêts de la quantification r = 0,691 r = 0,761 r = 0,722 Allice T et al (2006) J Med Virol, 78:

Agpp65 Real time PCR Cobas Amplicor (nombre de (log copies/ PBL) cellules/210 5 PBL)valeurs médianes (moyenne± écart-type) 0 2,6 (2,8  0,8)2,8 (2,8  O,5) 1-103,0 (2,9  1)2,9 (2,9  0,5) ,6* (3,  0,73,8** (3,7  0,3) ,0* (4,2  0,6)3,7** (3,6  0,3) ,2 (4,1  0,6) 3,9 (3,  0,2) >100 4,8 (4,7  0,7)4,0 (3,9  0,5) * p= 0,01, ** ns Intérêts de la quantification  biais de quantification pour les valeurs hautes de charge virale en PCR conventionnelle Allice T et al (2006) J Med Virol, 78:

Intérêts de la quantification Reproductibilité intra et inter-essai ADN CMV copies/réaction CV intra essai (%)CV inter essai (%) ,90,50,60,91,81,00,71,7 15,41212,211,549,632,723,721,3 Real time PCR Cobas Amplicor Allice T et al (2006) JMV (78):

Intérêts de la quantification 23 transplantés de foie et 4 de rein Surveillance hebdomadaire –Objectif : valider une PCR temps réel (TaqMan) pour la quantification du CMV dans le plasma et corréler les résultats avec l’antigénémie et la PCR plasmatique (Amplicor Monitor) Piiparinen et al, JCM 30 (2004)

R= 0,84 P< 0,0001 R= 0,80 P< 0,0001 R= 0,71 P< 0,0001 Piiparinen et al, JCM 30 (2004)

Intérêts de la quantification Messages –PCR quantitative en temps réel adaptée pour la quantification du CMV Bonne corrélation avec l’antigénémie et la PCR conventionnelle Meilleure performance technique : linéarité, seuil de détection et reproductibilité

LIMITES DE LA QUANTIFICATION

Limites de la quantification Absence de standardisation des méthodes de quantification du CMV rend difficile l’adoption d’une valeur seuil de l’antigénémie ou de la charge virale –Pour le diagnostic de la maladie à CMV –Pour prédire le risque de maladie à CMV Hétérogénéité des populations de patients (type de greffe, statut CMV du couple D/R, effectif variable …) Origine du prélèvement (sang total, leucocyte, plasma)

Quel seuil de l’antigénémie pp65 ? Seuil de l’antigénémie pp65 pour prédire le risque de maladie à CMV Type de greffeSeuil Agpp65Nombre patients Prévalence maladie à CMV (%) VPP (%) VPN (%) Référence Rein, coeur, foie  10 positive /10 5 leucocytes Bernabeu- Wittel et al, JID 2005 Moelle osseuse Dès la positivité Boeckh et al, Blood, cellule + par lame 7572 reinDès la positivité Van der Berg et al, Transplanta tion,1989 >1 cellule + pour leuco > 10 cellules + pour leuco 6996 >100 cellules + pour leuco 7588 Boeckh et al, Clin Microbiol Rev, , 1998

Quel seuil de l’antigénémie pp65 ? Seuil de l’antigénémie pp65 pour initier un traitement anticipé –Chez les transplantés d’organe solide :  10 cellules positives / 2 x 10 5 leucocytes –Chez les transplantés de moelle osseuse  cellules positives / 2 x 10 5 leucocytes Hallwachs et al. 1993; Locatelli et al. 1994

Quel seuil de l’antigénémie pp65 ? Seuil de l’antigénémie pp65 pour initier un traitement anticipé –Chez les transplantés d’organe solide  10 cellules positives / 2 x 10 5 leucocytes (rein) 100 cellules positives / 2 x 10 5 leucocytes (foie et coeur) –Chez les transplantés d’organe solide séronégatifs pour le CMV et de moelle osseuse  cellules positives / 2 x 10 5 leucocytes Boeckh et al., Blood 1996, Boeckh et al, ClinMicrobiol rev, 1998

Quel seuil de virémie ? Seuil de virémie pour prédire le risque de maladie à CMV Seuil de virémie pour initier un traitement anticipé  Pas de consensus Type de greffeSeuil virémieNombre patients Référence Foie10 5 copies ADN /ml de sang total 162  Risque de maladie à CMV 162 Cope et al, JID 1997 Cœur Foie 4 log 10 copies/ 10 6 leucocytes 73  Risque de maladie à CMV 73 V. Ghisetti et al. JMV (2004 Moelle osseuse>10 4 copies ADN/ml plasma 117  Risque de maladie à CMV Zaia et al, JID, 1997 Moelle osseuse>10 4 copies ADN/ml sang total 110RR = 6,46 (95% IC1,5- 27,4 Gor et al, BMT 1998 Boeckh et al, Clin Microbiol Rev, , 1998

Quel compartiment du sang ? Détection du CMV plus précoce dans les PBL par rapport au plasma Pellegrin et al., J Infect Dis 2000

Quel compartiment du sang ? Charge virale CMV sur sang total plus élevée (0,67 log) que sur plasma (p=0.0009) Charge virale CMV comparable dans les PBL et les PBMC Pas de différence significative de la baisse de la CV après traitement par du GCV parentéral entre SangTotal/plasma ou PBL/PBMC Sang total = compartiment de choix Razonable et al, Transplant (2002) 73: Gerna et al, Herpes (2006)13:1 Guarrigue et al, JCM (2006) 36: 72-75

Conclusion Méthodes de quantification du CMV : outils diagnostiques multiples Le choix de la méthode dépend de la question posée Chez le patient immunodéprimé –Dépister une infection active avant l’apparition de tout signe clinique –Apporter la preuve d’une maladie à CMV

Conclusions Antigénémie pp65 : –Méthode sensible pour évaluer la charge virale du CMV dans le sang –Adapté pour les laboratoires de petite taille et/ou pour un faible nombre d’antigénémie –Inconvénients Délai de traitement rapide de l’échantillon Technique manuelle, lecture subjective Faux négatif en cas de neutropénie

Conclusions ADN viral du CMV par PCR –Meilleure stabilité du génome viral par rapport à l’agpp65  prélèvement moins sensible au transport et possibilité de conservation du prélèvement –Adapté pour les grandes séries –Meilleure sensibilité des tests leucocytaires pour le diagnostic et la prédiction de la maladie à CMV –Sang total adapté au diagnostic de routine et dans le suivi thérapeutique

Conclusions Apport incontestable de la PCR quantitative en temps réel/ PCR conventionnelle –Évaluation plus précise de la cinétique de la réplication virale –Amélioration des performances techniques des tests utilisés –Automatisation –Possibilité de standardiser des protocoles de PCR

Perspectives Nécessité de standardiser les méthodes moléculaires de quantification sanguine du CMV Nécessité de valider un seuil pour chaque méthode quantitative et pour chaque indication (diagnostic et instauration d’un traitement anticipé) Nécessité de mettre en place d’un standard international de quantification du CMV  comparer les études utilisant des méthodes moléculaires très différentes

Démarche diagnostique Bilan pré-greffe Statut sérologique du donneur et du receveur greffe Surveillance hebdomadaire Antigénémie ADNémie ARNémie négatif Positif Traitement anticipé Risque de maladie À CMV faible ou nul Surveillance des marqueurs d’infection active sous traitement

FIN

Pathogénicité Fonction du statut immunitaire –Infections peu ou pas symptomatiques chez le sujet sain –Infections sévères chez les patients immunodéprimés Receveurs d’allogreffe de moelle ou d’organe Patients infectés par le VIH

Pathogénicité Infection à CMV –Patient asymptomatique –Signes biologiques d’infection active à CMV Maladie à CMV –Syndrome CMV : fièvre et leucopénie et/ou thrombopénie et/ou lymphocytose atypique et/ou élévation des transaminases –CMV invasif Dysfonction d’un organe Et localisation viscérale Paya et al, AJT 2004

Facteurs de risque et maladie à CMV Statut sérologique Donneur/Receveur (D/R) –D+/R- : primoinfection Risque d’infection : 100% Risque de maladie : 85% (sans traitement) –D-R+ : réactivation Risque d’infection : % Risque de maladie : 20% –D-R+ : réinfection Risque d’infection : % Risque de maladie : 20-40%

Facteurs de risque et maladie à CMV Immunodépression –Maladie à CMV entre le 1er et le 4ème mois après la greffe au moment où l’immunodépression est la plus forte Type de greffe Organe transplantéRisque de maladie sans traitement Rein, cœur, foie8-35% Pancréas, rein-pancréas50% Poumon, cœur-poumon70-80%

Méthodes de quantification du CMV –Antigénémie pp65 Moléculaires –PCR conventionnelle : Amplicor Monitor (COBAS, Roche) –PCR temps réel : Techniques maison +++ Trousses commercialisées (Argène Biosoft, Qiagen, Abbott….) –NASBA : Trousse Nuclisens pp67 test (Organon tecknika) Biomérieux –Hybridation moléculaire Hybrid Capture DNA Assay (Digene) Moléculaires Non moléculaires

Méthodes de quantification du CMV Méthodes moléculaires –PCR conventionnelle : Amplicor Monitor (COBAS, Roche) –PCR temps réel : Techniques maison +++ Trousses commercialisées (Argène Biosoft, Qiagen, Abbott….) –NASBA : Trousse Nuclisens pp67 test (Organon tecknika) –Hybridation moléculaire Hybrid Capture DNA Assay (Digene) PCR = Polymerase chain reaction NASBA = Nucleic acid sequence-based amplification

Limites de la quantification Valeurs des tests par rapport au diagnostic de la maladie à CMV : grandes variations

MarqueurPrélèvementFractionméthodesExpression des résultats VirémieSang hépariné (10ml) Leucocyte (L) Culture classique ou rapide Nb de cellules infectées/ 10 6 L Antigénémie (Agpp65) Sang hépariné ou EDTA (5ml) leucocyteImmunofluores- cence Nb noyaux +/ 2x10 5 L ADNémie leucocytaire Sang EDTA ou citrate (5ml) leucocytePCRNb copies /ml ADNémie Plasmatique ou sérique Sang EDTA ou sec (5ml) Plasma sérum PCRNb copies /ml ARNémieIndifférent (0,2ml) Sang totalNASBA Marqueurs sanguin d’infection active

MéthodesAvantagesInconvénients Virémie par Culture Isolement viral Etude de la résistance Long (1 à 6 semaines), fastidieux, Equipement spécifique, faible sensibilité, risque de contamination bactérienne ou fungique, acheminement rapide au laboratoire Culture rapide Rapide (48 heures)Equipement spécifique, faible sensibilité, toxicité cellulaire, acheminement rapide au laboratoire Antigénémie pp65 Rapide (5 à 6 heures), standardisée acheminement rapide au laboratoire, faux négatif si neutropénie Méthodes de quantification du CMV Méthodes non moléculaires

Intérêts de la quantification Bernabeu-Wittel et al, JID 2005

Intérêts de la quantification Messages –PP65, Cobas et TaqMan : équivalentes pour la quantification du CMV –Avantage de la PCR temps réel : Meilleure sensibilité (250 contre 400 copies/ml) Meilleure reproductibilité intra-essai (1% contre 12% pour cobas) et inter-essai (2% contre 30%) Gamme de linéarité étendue (250 à 25 millions de copies/ml) Adapté pour les grandes séries

JS. Kalpoe, J. Clin Microbiol (4): Quel compartiment du sang ? 409 échantillons (transplantés d’organe et de moelle osseuse) Plasma : nombreux avantages (facilité de prélèvement, de conservation…)

Pathogénicité Fonction du statut immunitaire de l’hôte Receveurs d’allogreffe de moelle ou d’organe –Infection à CMV : Patient asymptomatique Signes biologiques d’infection active à CMV –Maladie à CMV Patient symptomatique (fièvre…) Et/ou localisation viscérale Paya et al, AJT 2004

Facteurs de risque et maladie à CMV Facteurs de risque de survenue d’une maladie à CMV après greffe d’organe –Statut sérologique CMV du couple Donneur/Receveur –Présence des marqueurs d’infection active dans 85% –Traitement immunosuppresseur –Organe greffé –…

Stratégies thérapeutiques TRAITEMENT CURATIF Ganciclovir Valganciclovir Cidofovir Foscarnet TRAITEMENT PRÉVENTIF Ganciclovir Valganciclovir valaciclovir infection symptomatique à CMVH receveur d’allogreffe

Stratégies thérapeutiques traitement anticipé ou preemptive : –initié lors de la détection d’un marqueur biologique d’infection active en l’absence de symptômes cliniques –Europe traitement prophylactique –chez tout receveur profondément immunodéprimé à haut risque de développer une infection grave à CMVH –3 mois –USA Traitement préventif

MéthodesAvantagesInconvénients Virémie par Culture Isolement viral Etude de la résistance Long (1 à 6 semaines), fastidieux, Equipement spécifique, faible sensibilité, risque de contamination bactérienne ou fungique, acheminement rapide au laboratoire Culture rapide Rapide (48 heures)Equipement spécifique, faible sensibilité, toxicité cellulaire, acheminement rapide au laboratoire Antigénémie pp65 Rapide (5 à 6 heures), standardisée acheminement rapide au laboratoire, faux négatif si neutropénie Méthodes de quantification du CMV Méthodes non moléculaires

Quel compartiment du sang ? Gerna et al Herpes 13: –Sang total : compartiment de choix Guarrigue et al JCM 36 (2006) –Sang total et fraction leucocytaire : compartiments de choix –Agpp65 + à 50 cellules  3,8 log 10 copies/ml de sang total –3,6 log 10 copies/ml sur sang total = seuil pour déterminer une infection active

Quel seuil de virémie? Seuil de virémie pour initier un traitement anticipé –Chez les transplantés d’organe solide : 1000 à 5000 copies /ml de plasma (Cobas Amplicor) –Chez les transplantés de moelle osseuse Dès la détection de l’ADN plasmatique

Quel seuil de virémie? Seuil de virémie pour initier un traitement anticipé –Chez les transplantés d’organe solide : copies /ml de sang total –Chez les transplantés de moelle osseuse copies /ml de sang total Gerna et al Herpes 13:1 2006