LA BIO-PROTECTION ACTIVE EN REPONSE AUX IMPASSES OENOLOGIQUES Stéphane YERLE Ingénieur en Agriculture - Oenologue Stéphane Yerle Consultant – 20 rue Voltaire – 34370 Cazouls les Béziers www.syerle.com

Bio-protection passive Des problématiques issues du terrain. Vignobles méridionaux Stress hydrique Blocages de maturité Degrés élevés Contrainte variétale Cépages phénoliques Blancs lourds Rouges Brettanomyces Besoins commerciaux Profils thiols Profils terpène Profil des vins rouges Richesse Harmonie en bouche Retour au naturel Bio-protecion active Bio-protection passive L’ensemble des problématiques abordées dans cette présentation sont issues du terrain, principalement le sud de l'Europe, des terroirs présentant bien souvent des maturités chaotiques, après de nombreuses périodes de stress hydrique ou nutritionnel tout au long du cycle végétal. Cette évolution dans les processus de vinification va aussi dans le sens d’une évolution sociétale réclamant des aliments toujours plus « naturels » c’est-à-dire intégrant des ressources technologiques directement issues de la nature et moins létales comme le soufre. Ce retour au naturel ne signifie pas pour autant l’abandon de technicité dans le profilage des vins et la bioprotection active offre de nouvelles perspectives œnologiques aux vinificateurs.

Agressivité des vins rouges Valorisation de la bio-protection active. Problématique : rapport gras/structure déséquilibré Solution : Diminuer l’extraction de tanin et augmenter la prise de gras Agressivité des vins rouges Problématique : manque d’acidité / aspects sensoriels ou œnologique (SO2 actif). Lourdeur des arômes et amertume des vins blancs et rosés Solution : production d’acidité en fermentation. Manque de fraîcheur Problématique : pression brettanomyces dès le vignoble sur cépage et vin à forte teneur en acides phénols. Solution : diminuer l’extraction d’acides phénols et enchainer les microflores positives. Brettanomyces Eviter les piqures lactiques à l’écoulage par ensemencement préfermentaire avec bactérie homofermentaire. Risque Brettanomyces : redémarrage de fermentation rapide sans phase de latence . Macération grappe entière Cinq thématiques seront abordées, toutes en phase avec une modernisation des styles de vins, à savoir une plus grande expression aromatique, du volume et de l’harmonie en bouche et enfin de la stabilité.

Causes de l’agressivité Agressivité des vins rouges. Définition de l’agressivité Causes de l’agressivité Intérêts de la bio-protection Approche chimique et tactile de l’astringence Rapport gras/structure : opposé de l’harmonie (CQFD gustation) Variétale : ratio T/A, % tanins galloylés Terroir : maturité, stress hydrique et nutritionnel Extraction : phase aqueuse/alcoolique, sulfitage vendange, pépin/pellicule Limitation voire abandon du pouvoir solvant du sulfitage Extraction pré-fermentaire en phase aqueuse prolongée Gain de volume et gras en bouche avec Torulaspora Delbrueckii Prelude. L’agressivité, c’est tout simplement un manque de gras ou un excès relatif de perception de la structure en bouche qui occasionne une agression de la muqueuse par assèchement et diminution du pouvoir lubrifiant de la salive. Le rôle prépondérant des tanins galloylés issus du pépin ainsi que de la polymérisation oxydative des flavanols en absence d’anthocyanes sont déterminants de cette agressivité et bien souvent les vins du Sud présentent une extraction tannique excessive associée à de la sécheresse renforcée par l’alcool. L’idée de la bio protection est de recentrer l’extraction dynamique en phase aqueuse mais aussi et surtout en absence de sulfitage : le dioxyde de soufre est un solvant excessif en zone chaude, alors que parfois indispensable en zone froide ou septentrionale de moindre maturité. L’extraction pré fermentaire en absence d’alcool permet également de laisser travailler sur 48 heures des souches de levures apportant du gras afin de mieux enrober la structure et rendre les vins plus harmonieux, c’est le rôle de Torulaspora Delbrueckii.

Torulaspora delbrueckii – effets sur le volume en bouche : production élevée de polysaccharides Mannoproteins and polysaccharide production: Ideal to improve wine body in barrel /oak chips production Significant increase of polysaccharides especially when initial S.c. concentration is low Significant increase of Low molecular weight proteins Source: Comitini, F., et al., Selected non-Saccharomyces wine yeasts in controlled multistarter f..., Food Microbiology (2011) Torulaspora Delbrueckii est alors utilisée pour sa capacité à enrichir le vin rouge en bouche par libération de polysaccharides, en absence de saccharomyces cerevisiae, sur une paire de journées, rallongeant ainsi la période d’extraction en phase aqueuse, favorable au ration tanins/anthocyanes. Influence of Torulaspora delbrueckii on the protein fractions of a base wine and corresponding sparkling wine. Source: Medina Tujillo L. et al. (2016) 5 27 November 2018

Causes du manque de fraîcheur Définition de la fraîcheur Causes du manque de fraîcheur Intérêts de la bio-protection Acidité en bouche ; Arômes de fruit frais ou rafraichissants (cinéol, balsamique…) Manque d’acidité et limites de l’acidification ac. tartrique pur (charte AB); Arômes primaires de surmaturité : terpènes et norisoprénoides en zone méridionale ; Arômes secondaires beurrés : diacétyle ; Arômes tertiaires Prémox : tendance phénolique des blancs et rosés. Sulfitage différé ou Oxygénation ménagée : diminution des acides phénols et flavanols ; Révélation aromatique par ensemencement de Pichia Kluyverii (Frootzen) directement à la parcelle ; Acidification pré-fermentaire : succinique et lactique par Lachancea thermotolerans Concerto ; Production de diacéthyle nulle par Oenoccus oeni citrate négative (CinE). La fraîcheur se définit par la présence d’arômes rafraichissants ou de fruits frais, mais aussi l’absence d’arômes surmûrs, lourds, beurrés ou de type oxydatifs (rances) pour les vins blancs (premox, cire, miel, vernis, 2-aminoacétophénone…). En bouche, l’acidité est souvent associée au descripteur tension quand il s’agit d’effet rafraîchissant, rarement lié à l’acide tartrique, souvent qualifié d’acide dur. Les acides lactiques et succiniques font partie des acides organiques provoquant longueur et fraîcheur en bouche.

Manque de fraîcheur : éliminer le risque Premox par oxygenation contrôlée… Phénols totaux en mg/l Agrément sensoriel Maximum Minimum MAIGRE HAMONIEUX AMERTUME 100 150 175 200 225 250 275 125 L’absence de sulfitage de la vendange en vinification de vins blancs et rosés permet un brunissement enzymatique issu de la peroxydation des flavanols par le couple polyphénol-oxydase et acides phénols, de façon naturelle et sans risque de sur-oxygénation. En effet, le sulfitage différé (ou sulfitage du moût au cuvon) permet non seulement de ne pas extraire de flavanols et acides phénols mais aussi de stabiliser ces derniers polyphénols dans le cas de raisins présentant de faibles taux de gluthation (stress hydrique et/ou nutritionnel). Naturellement les doses d’oxygène se trouvent apportées par le pressurage et le transfert du moût, mais dans certains cas un rajout peut être nécessaire pour éliminer davantage de flavanols : cépages phénoliques tels la Clairette oui le Grenache Blanc, ou encore certaines fractions de jus de presse. La bio protection peut alors agir naturellement en se substituant au dioxyde de soufre sans entraver le rôle de la ppo (inhibée à partir de 30 mg/l de soufre total).

FrootZen™ avoid grape oxidation and enable to reduce the must Vins Sans sulfite ajouté : Pichia kluyveri “piège à Oxygène” Disolved oxygen Time (h) Control L’intérêt de l’oxygénation des moûts réside dans la réduction et la prévention à terme de l’évolution oxydative des vins blancs et rosés à tendance phénolique (cépages méditerranéens en zone de stress hydrique ou nutritionnel). Dans le cas des moûts dépourvus d’acides phénols et flavanols et/ou riches en glutathion (cépages réducteurs colombard, sauvignon, verdejo…) il peut au contraire être intéressant de consommer l’oxygène dissous lors des opérations pré-fermentaires par une levure non saccharomyces de type Pichia Kluyveri pour conserver les arômes floraux. On Sauvignon At cold setling FrootZen™ avoid grape oxidation and enable to reduce the must P. Kluyveri : Frootzen™ VL3 : S.cerevisiae

1 2 Augmentation de la fraîcheur grâce au combo : Concerto™+CiNe™ Lachancea thermotolerans ex Kluveromyces thermotolerans augmente l’acidité par la production d’acide lactique et succinique, de perception harmonieuse en bouche. (Viniflora® Concerto™) Oenococcus oeni citrate negatif (Viniflora®CiNe™) révèle une intense expression du fruité par une fermentation malolactique sans formation de diacétyle pH pH 3.6 On peut alors utiliser une levure non saccharomyces de type Lachancea thermotolerans pour acidifier le moût blanc ou rosé à l’issue de cette phase de brunissement tout en préservant la fraîcheur aromatique lors de la fermentation malolactique en utilisant une souche de bactérie citrate-négative ne produisant pas de diacétyle. Les acides lactiques et succiniques produits massivement en début de fermentation alcoolique seront ensuite estéridfiés pour partie durant la fermentation alcoolique pour aboutir à des esters d’acides fixes responsables du caractère fruité des vins. Ce couple de micro-organismes permet donc de stabiliser naturellement des vins frais, aromatiques et possédant du volume et de la tension en bouche. Moût Paramètres requis pour la meilleure performance de CiNe™ Température Ethanol pH SO2 total Amino nitrogen (FAN ) 17-25°C ≤14% v/v ≥3.2 ≤30 ppm >60 ppm Concerto™: Conversion d’une fraction des sucres en acide lactique Acidité agréable Possible réduction du taux d’alcool. CiNe™: Souche de Oenocuccus oeni citrate négative, qui permet une stabilisation naturelle par fermentation malolactique sans l’inconvenient de l’arôme beurré, provenant de la dégradation du citrate ** Perception nette en bouche Pure expression fruitée 1 2

Vins Sans sulfite ajouté : intérêt de Pichia kluyveri comme révélateur d’arômes. FrootZen™ used on grapes at the harvest Pellicular maturation (Rosé) Co-fermenting S.cerevisiae and FrootZen™ in Sauvignon blanc at 14°C Ethyl octanote: pineapple, brandy, pear (threshold 0.2 g/l) Ethyl decanoate: apricot, sweet, brandy (threshol 0.1 g/l) Ethyl dodecanoate: waxy, floral (threshold 1.2 g/l) Organic merlot, wine making without SO2, 23°C Parmi les actions des micro-organismes utilisés pour la bio protection des vins blancs et rosés sans sulfites, la révélation d’arômes fermentaires ou réducteurs variétaux procure une plus grande expression aromatique du vin une fois conditionné. Flavour booster! Control Concerto™ Frootzen™ 10

Sans sulfites: consommer rapidement l’éthanal résiduaire de FFA…sans diacétyle. Stabilization of the wine by malolactic fermentation: Viniflora® CiNe™ -a specific metabolism for a crisp fruit flavor Diacetyl : 3-4 µg/l Below sensory threshold No citrate uptake No citrate degradation into diacetyl and acetoin  No buttery flavor Non seulement CiNe ne produit pas de diacétyle mais au-delà préserve la teneur naturelle du moût en acide citrique, lequel procure fraîcheur et longueur du vin blanc en bouche. From publication ”Revue des Oenologues, N°161 special, Nov 2016, pp 65-68” Blend Roussanne & Marsanne

Diminution des doses de SO2 : consommer rapidement l’éthanal résiduaire de FFA et abaisser le Redox. Stabilization of the wine by malolactic fermentation: examples of kinetics in wine Les vins sans sulfite ne bénéficient pas du pouvoir tampon du dioxide de soufre : le défaut mousy off-flavor peut s’inverser lorsque le redox du vin baisse. Un des éléments les plus critiques de l’élaboration des vins rouges sans sulfite est connu aujourd’hui sous le terme de moussy off-flavor perçu par les dégustateurs dans des vins contenant des tétrahydropyridines. Ces composés produits par des bactéries ou des Brettanomyces à partir d’acides aminés du raisin s’exprime pour des potentiels redox élevés. Effectivement la forme oxydée de cette molécule est 100 fois plus aromatique que sa forme réduite, d’où l’intérêt de refermer rapidement le vin rouge en sortie de fermentation malolactique par le choix d’une souche de bactérie adaptée au milieu à coloniser. Le caractère moussy off-flavour augmente généralement lors des phases oxydatives du vin rouge : le choix d’une souche de bactérie homofermentaire permet de limiter les risques de déviance en cas de traces de sucres et toute intervention traumatisante voire oxydante pour le vin rouge : centrifugation, filtration qui généralement sont suivies de l’apparition du goût de souris pour de longs mois, le temps que le vin se réduise à nouveau. Malic acid converted in 22 days with Viniflora® Oenos, whereas spontaneous fermentation >>30 days

Fermentation alcoolique Augmentation de la fraîcheur grâce au combo: Concerto™+CiNe™ P Population Temps Lachancea thermotolerans Saccharomyces spp. Oenococcus oeni Fermentation alcoolique Fermentation malolactic Pré-fermentation Souche peu productrice de SO2 2 Ce couple de micro-organismes permet par exemple d’élaborer des vins blancs de Chardonnay méridionaux possédant du gras en bouche mais avec de la fraîcheur, loin des caricatures phénoliques, beurrées et oxydatives rencontrées hors de sa bourgogne natale. Concerto™ CiNe™ Inoc. Concerto™ 20g/hl au remplissage du tank filling Inoc. Sacc. tardive (après 48-72h) Inoc. CiNe™ (Co-inoculation tardive*) *Densité 1010+/-10

Wine making parameters Sans sulfites: choisir la bonne souche pour une FML rapide dans tous les cas. Choose the set that suits your needs Wine making parameters Cultures benefits Culture Temperature (°C) Max :25°C Alcohol %(v/v) pH SO2 (ppm) Preferred Inoculation timing(**) R EC LC S Flavor Summary Viniflora® Oenos ≥17 ≤14 ≥3.2 ≤40 x Fruity ++ Buttery ++ “The Classic” For most wines Viniflora® CH11 ≥14 ≤15 ≥3.0 ≤35 “The fast track” Low pH, Low T°C, Fast MLF Viniflora® CH16 ≤16 ≥3.4 Fruity + Spicy++ “The character” High Alcohol, High maturity Viniflora® CH35 ≥15 ≥3.1 ≤45 Buttery +++ “The hard worker” Secure MLF, High SO2, Buttery styles Viniflora® CiNe™ ≤30 Fruity +++ Buttery - “The fruit keeper”, MLF benefits with sacrificing the fruity flavours Viniflora® NoVA™ 18-30 ≤5 ≥3.5 Fruity ++++ Buttery + “The outsider” NO SO2 wines, Fruit driven styles Viniflora® SPARTA™ “The easy rider” Fast MLF, High SO2, Low pH The culture for difficult malo FroZen™ cultures are available in bags for 100 hl and/or 250 hl. SPARTA is for flexible doses. To be stored at -50°C Freasy™ cultures are available for 50 hl. To be stored at -18°C for a shorter period. (*)Only CiNe, CH11 and CH16 are available as Freasy™. Freeze-dried cultures (Oenos, Oenos 2.0, CH35 and CH16) are available for 250 l (barrels), 25 hl and 250 hl. CiNe™ and CH11 are available for 25 hl. Il est primordial de choisir la souche de bactérie adaptée aux conditions dans lesquelles elle devra s’implanter le plus rapidement possible, voir le plus parfaitement possible. Il ne faut surtout pas exclure la teneur en nutriments du milieu ainsi que la teneur en sulfites, notamment ceux produits par la levure saccharomyces cerevisiae, certaines souches produisant plusieurs dizaines de mg/l de soufre total. Il est donc communément admis d’utiliser des souches neutres mais bonnes finisseuses pour les vins rouges, telles ICV OKAY, BCS 103 (Lesaffre) ou en encore MARQUISE (Sofralab) puis à l’issue de la fermentation alcoolique doser l’azote aminé libre NOPA pour correction si nécessaire dans le cas d’une fermentation malolactique languissante.

Limites et contraintes en production : Brettanomyces bruxellensis. Problème Brettanomyces : Limites et contraintes en production : Intérêts de la bio-protection Causes variétales (richesse en acides phénols) et viticoles (intégrité pellicule et micro-climat grappe – Barbin, 2006) ; Causes œnologiques : phase de latence pré et post fermentaires non maîtrisées, traces de glucose-fructose (Gilis, 2003) ; Difficultés d’implantation des levures sèches actives classiques (Saccharomyces cerevisiae) vs autochtones ; Fins de F.A. lentes et incomplètes sur raisins déséquilibrés (carences en Nass) ; Variabilité de la sensibilité des souches au soufre actif (Curtin et al., 2012). Extraction limitée d’acide p-coumarique en absence de sulfitage ; Enchaînement dynamique de populations de l’encuvage jusqu’en fin de malo avec raccourcissement des phases de latence ; Achèvement des fermentations par ensemencement mixte sacc/non sacc. Ici, la préoccupation principale est d’extraire le minimum d’acides hydroxycinnamiques, précurseur des éthyl-phénols mais ayant surtout une relation particulière avec les souches de Brettanomyces. Cette levure a la particularité de ramener constamment la teneur en acides para-coumarique du vin en deçà d’une certaine concentration, l’augmentation en phénols volatils étant le résultat de cette « décontamination ». L’élimination du soufre à l’encuvage permet tout d’abord de diminuer l’extraction de ces acides phénols, tout en dynamisant l’enchaînement de populations, de l’encuvage jusqu’à l’achèvement de la fermentation malolactique. Il en résulte une moindre présence de Brettanomyces à tous les stades de la fermentation d’autant plus que la bio-protection active est facilitée en absence de soufre.

Bio-protection active vs Brett : enchaînement dynamique de populations microbiennes. PRELUDE™ FrootZen™ CONCERTO™ CiNe™ Viniflora® Oenococcus oeni Protection Broad protection against yeasts and molds + Specific protection towards yeast Brettanomyces (+) Specific protection towards mold Botrytis Protection towards acetic bacteria (Acetobacter, Gluconobacter) Protection towards lactic bacteria (Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus…) Red ox Anti-oxidation Flavor impact Reduction of volatile acidity Increase of flavor intensity Increase of Freshness/Fruitiness Safety No production of biogenic amines* L’intérêt de protéger la vendange avec Concerto dès l’encuvage réside dans l’abaissement du pH par production d’acide lactique, rendant ainsi l’efficacité du soufre actif grandement améliorée ultérieurement en élevage. Dans le cas où les vendanges sont naturellement acides (raisins biologiques plus souvent carencés en potassium et à l’acidité concentrée en fin de cycle de maturation) il est alors possible de moduler l’acidification par usage combiné de Concerto associé à Prélude. 20 *: Histamine, Tyramine, Cadaverine, Putrescine. (): need to be further investigated

Inhibiting compound –Lactic acid pH 3.6 Example: Increase of Non-volatile acidity and decrease of pH with Pichia Kluyveri (Viniflora® Frootzen™ )and Lachancea thermotolerans (Viniflora® Concerto™ respectively. A higher acidity unsures a protection against unwanted flora. La production d’acide lactique et dans une moindre mesure d’acide succinique par Pichia Kluyveri (Viniflora® Frootzen™ ) and Lachancea thermotolerans (Viniflora® Concerto™) jusqu’à 1,5 g/l avant la fermentation alcoolique permet d’abaisser significativement le pH du moût. Organic merlot, wine making without SO2, 23°C

Bio-protection active vs Brett : enchaînement dynamique de populations microbiennes. Lachancea thermotolerans Pichia Kluyveri Torulaspora delbrueckii ... Saccharomyces cerevisae Oenococcus oeni Populations Time Pre-fermentation Alcoholic fermentation Malolactic fermentation for juice and must improvement for wine improvement Reduce initial concentration of contaminants Prevent contaminant from growing Increase acidity and reduce alcohol Avoid use of SO2 Avoid growth of undesirable flora (Bacteria: Lactobacilli, Pediococci , non selected Oenococcus or yeast: Brettanomyces) Avoid off-flavor and biogenic amines linked to contaminants Avoid use of SO2

Causes d’échec des macérations Macération grappe entière. Déviations des macérations carboniques Causes d’échec des macérations Intérêts de la bio-protection Piqure lactique à l’écoulage ; Production d’acétate d’éthyle par Kloeckera apiculata et bactéries acétiques Mauvaise saturation en CO2 ou température trop basse ; pH élevé par diffusion potassium des rafles ; Contamination du vin par bactéries lactiques hétérofermentaires à l’écoulage ; Arrêt de fermentation à l’écoulage suivi d’une contamination par Brettanomyces ; Extraction limitée d’acides phénols précurseurs des éthyl-phénols en absence ou limitation de sulfitage ; Acidification par Lachancea Thermotolerans Concerto. Appauvrissement en acide malique du jus de fond de cuve par Lactobacillus plantarum Nova ; Reprise de FA à l’écoulage facilitée sans soufre ; La technique de macération grappe entière ou macération carbonique est grandement adaptée aux cépages méditerranéens comme Carignan, Grenache, Syrah et Mourvèdre mais présente de nombreuses difficultés liées au chevauchement de plusieurs fermentations, et il arrive fréquemment de rencontrer des problèmes de piqure lactique suite à l’écoulage lors de la reprise de fermentation alcoolique. En effet, les bactéries lactiques se développent durant la macération et peuvent ensuite provoquer une piqure en consommant une partie des sucres, c’est pourquoi classiquement les macérations carboniques sont acidifiées et sulfitées, parfois traitées au lysozyme. La bioprotection active présente un intérêt par la consommation d’acide malique durant la macération à l’aide d’une souche homofermentaire de lactobacilus plantarum Nova., de sorte qu’à l’écoulage ou lors de macérations prolongées plus de dix jours les risques de piqûre lactique sont nuls.

Macération carbonique : le risque acétate(s). Impact de cinq techniques de macération sur les caractéristiques analytiques, aromatiques et sensorielles des vins rouges – projet Vinaromas. La production excessive d’acétate d’éthyle est un autre problème fréquemment rencontré dans les macérations carboniques qui ne chauffent pas, souvent en raison d’une population de levures apiculées trop élevée. L’un des moyens proposé dans le cadre d’une bio protection active consiste à occuper le milieu à l’aide de Lachanceans Kluyverii qui va également acidifier le milieu pour compenser l’extraction majorée de potassium des rafles par la macération carbonique.

Reduction of the risk of growth of molds Carbonic maceration: Early bio-control by Lactobacillus plantarum (Viniflora® NoVA™) Reduction of the risk of growth of unwanted lactic acid bacteria with Viniflora® NoVA™ (Lactobacillus plantarum is homofermentative and does not produce any acetic acid) Merlot grape juice at pH 3.5 and 3.8 L. plantarum viable in the pH 3.8 Mould inhibition in the pH 3.8 juice Merlot, South of France L. plantarum inoculated to the test tank YGC plates on day 4 (Control and test tank) Le couple NovaTM et Concerto permet de stabiliser et sécuriser la macération préfermentaire en inhibant divers micro-organismes, réduisant ainsi la teneur en acide acétique des vins. pH 3.5 juice to the left & pH 3.8 juice to the right Control to the left & Test with L. plantarum to the right Reduction of the risk of growth of molds

Alcoholic fermentation Malolactic fermentation Macération carbonique : enchaînement dynamique de population. Process itinerary: For a carbonic maceration of a Carignan Population Time Saccharomyces bayanus Lactobacillus ssp. Alcoholic fermentation Malolactic fermentation Non-Saccharomyces L.thermotolerans Oenococcus oeni Il peut parfois être nécessaire d’ensemencer à nouveau le moût après écoulage en fin de fermentation malolactique pour achever de consommer l’acide malique résiduel extrait lors du pressurage, dans ce cas on choisit alors une souche adaptée au milieu. Viniflora® CH35 Viniflora® NoVA™ Pressurage Viniflora® CH16 Concerto™ Inoc. NoVA™ (au remplissage de la cuve) Inoc. Concerto™ 20g/hl après 24-48h Inoc. Sacc. tardive Après pressurage Inoc. complémentaire CH16™ (Si nécessaire)

Merci pour votre attention. En conclusion, la bio protection active offre de nombreuses perspectives d’application, limitant les additifs et sécurisant de nombreuses vinifications spéciales, parfois abandonnées jusqu’alors en raison d’un risque accru de déviance.