Clonage Moléculaire

Définitions Clonage : Sous-clonage: Plasmide recombinant: Obtenir un morceau d’ADN à partir de la source originale (Génome) et l’introduire dans un vecteur d’ADN Sous-clonage: Transfère d’une insertion d’ADN cloné ou d’une partie de celle-ci d’un vecteur à un autre vecteur Plasmide recombinant: Vecteur dans lequel un ADN étranger a été introduit Organisme recombinant Organisme dans lequel un vecteur recombinant a été introduit

Pourquoi cloner? Séparer, identifier, manipuler ou exprimer un fragment spécifique d’ADN 3

Étape 1- Séparer Deux approches: Fragmenter/digérer l’ADN génomique Génère un très grand nombre de fragments Peut-être difficile de retrouver le fragment d’intérêt Amplification par PCR Beaucoup moins de fragments Beaucoup plus facile de retrouver la séquence d’intérêt

Réplication & Amplification d’ADN La Réaction de la Polymérase en Chaîne

Polymérases Amorce -OH Extrémité 3’OH Polymérase 5’…GTACT 3’…CATGAATGCTGCATTTGCGGGCATTACTC…5’ TACGACGTAAACGCCCGTAATGAG Matrice d’ADN ou ARN

La Réaction de la Polymérase en Chaîne Réplication répétitive d’une région donnée d’ADN Permet l’amplification exponentielle d’une région donnée d’ADN Augmente la représentation relative d’une région d’intérêt Permet l’isolation d’une région donnée d’ADN 7

PCR-1ier Cycle <3’GGAACGGTACCGT5’ Dénaturation (95oC) Appariement des amorces (Tm) <3’GGAACGGTACCGT5’ 5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’ 3’GTATGGCACCCCACGA………..TGCGCAACGCTACCGT5’ 5’CCGTGGGGT3’>

5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’ Extension (72oC) <3’GGAACGGTACCGT5’ 5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’ 3’GTATGGCACCCCACGA………..TGCGCAACGCTACCGT5’ 3’ 5’ --------------------------------  ----------------------------------  5’CCGTGGGGT3’> 9

PCR-2e Cycle 3’ 5’ ---------------------------------- -------------------------------------- 5’ 3’ 3’ 5’ ---------------------------------- -------------------------------------- Dénaturation -------------------------------  ----------------------------------  Appariement /Extension --------------- ----------------

PCR- Cycles Subséquents Seulement cette matrice est amplifiée de façon exponentielle : 2n fois -------------------- ------------------- ------------------------ ------------------------ ------------------------ 32 fois totale

Survol des Cycles du PCR Amorces: Courte séquence nucléotidiques simple brins complémentaires aux cibles 15-30 nucléotides Utilisée en excès comparativement à la cible afin de favoriser l’appariement des amorces plutôt que l’appariement des matrices

Survol des Cycles du PCR Appariement: Température à laquelle les amorces s’apparient aux séquences complémentaires Dois être sous le Tm des amorces Dois être une température qui permet aux deux amorces de s’apparier Habituellement entre 55-75oC Extension: Fait à la température optimale pour la polymérase ADN Habituellement 72-75oC pour la polymérase Taq

Amorces Caractéristiques: Courts oligonucléotides complémentaires aux séquences qui bordent la région d’intérêt Établis le point d’initiation de la réplication Établis le point de terminaison de la réplication 14

Conception d’Amorces Complémentarité 5’ 3’…………….ATGGGTATTGGCC…………………..-5’ Matrice CCATAACCGG-OH3’ 5’CGA Complémentarité 3’ 3’…………….ATGGGTATTGGCC…………………..-5’ Matrice TACCCATAACC TA-OH3’ 15

Conception d’Amorces 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ Région d’intérêt 3’ Bonne orientation Mauvaise orientation 16

Problème 1- AAAAAA 2- TTTTTT 3- GGGGGG 4- CCCCCC 5’-AAAAAAAAAAAA GGGGGGGGGGGGG-3’ Vous désirez amplifier la séquence représentée par la boite. Quelle paire d’amorces est dans la bonne orientation pour accomplir ceci? 1- AAAAAA 2- TTTTTT 3- GGGGGG 4- CCCCCC 17

Utilité le la PCR Amplification et isolation d’une région donnée en changeant sa représentation relative Entre 100pb et 10Kpb Criblage pour déterminer la présence d’une séquence d’intérêt Présence ou absence d’un produit d’amplification Mutagenèse dirigée Utilisé pour ajouter ou enlever des nucléotides sur la matrice originale 18

Cloner Enzyme de restriction Enzyme de restriction Générer des extrémités compatibles Ligature d’ADN Vecteur approprié Fragment d’intérêt Ligature Intermoléculaire Recombinant Ligature Intramoléculaire Non-Recombinant Transformation Cellules Hôte Cellule Recombinante Cellule Non-Recombinante 1 plasmide/1 cellule

Amplification des Plasmides Recombinants Duplication de plasmide 1 colonie= 1 clone avec 1 plasmide + 1 insert Croissance bactérienne

Criblage et Identification de Clones Recombinants Plasmidiques Criblage bleu – blanc Cartographie de restriction Hybridation PCR

Criblage pour les recombinants Complémentation alpha Criblage “Bleu-blanc" β-galactosidase (LacZ) Peptide-α (aa 1-92) - Inactif Peptide ω (reste de LacZ) –Inactif Peptides α + ω  β-galactosidase active

Complémentation Alpha Utilisé dans plusieur vecteurs Promoteur LacZ SCM – Sites de restrictions pour le clonage Extrémité 5' du gene LacZ - α-peptide Discrimination d’E. coli avec: Vecteur vide Vecteur + insertion d’ADN

Criblage bleu- blanc E.coli → LacZ ω pUC19 → LacZ α Milieu de croissance avec X-gal E.coli - LacZ ω + plasmide avec insertion PAS de LacZ α → colonies blanches E.coli - LacZ ω + plasmide sans insertion LacZ α → colonies bleues