Testing ALK : enjeu majeur pour le pathologiste et le clinicien Pr. L. LARAQUI Laboratoire de Pathologie du Centre Plateforme de biologie moléculaire Casablanca

REFERENTIEL Adénocarcinome localement avancé EGFR négatif Seules les tumeurs non a petites cellules et non malpighiennes sont éligibles a un testing moléculaire La recommandation actuelle pour les tests alk et ros1 est principalement pour l'adénocarcinome, les cancers du poumon avec une composante d’adénocarcinome ou des cancers non à petites cellules. Cependant, les analyses alk et ros1 dans le carcinome épidermoïde ont été limitées, et les tests sont justifiés chez les non-fumeurs avec cette histologie tumorale

Problème de fixation ++++ Probleme de délai FISH /IHC Biopsie : MATERIEL PRECIEUX+++ CYTOLOGIE : cell block Fixateur : FORMOL 10% tamponne PRIMITIF /METASTASE DECALCIFIANT XXXXXXX (acide chlorydrique ) Ancien bloc : pas moins de trois ans Stockage de lame Cellularite : + de 50 cellules 6H-72 H Problème de fixation ++++ Probleme de délai FISH /IHC Neogenomics protocol : Formol 5%

Anaplastic Lymphoma Kinase ALK

La protéine Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) est un récepteur à activité tyrosine kinase, codé par un gène de 4,9 kb sur le bras court du chromosome 2 (2p23) et ayant une homologie de structure avec la famille des récepteurs à l’insuline. Ainsi, elle se compose de 3 domaines: un domaine extracellulaire, de liaison des ligands qui sont les facteurs de croissance neutrophiliques un domaine intracellulaire possédant un domaine kinase un domaine de dimérisation.

En 2007, une anomalie génétique concernant le gène codant pour la kinase ALK a été décrite par M. Soda et al. dans les CBNPC ; cette anomalie procède d’une translocation entre 2 gènes, le gène ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) en 2p23 et le gène EML4 (Echinoderm Microtubule associated protein Like 4) en 2p21.

ALK : presque dix ans !

De multiples variants ont été décrits De multiples variants ont été décrits. Ces variants impliquent l’exon 20 du gène ALK qui code pour le domaine TK intracytoplasmique et la région d’EML4 qui code pour le domaine coiled coil aminoterminal d’EML4 nécessaire à l’activation d’ALK ; les variants EML4-ALK les plus fréquents sont E13;A20 et E6;A20, observés dans 33 et 29 % des cas. D’autres partenaires qu’EML4 ont été rapportés, tels que TFG (TRK-fused gene), KIF5B (kine-sin family member 5B) et KLC1 (kinesin light chain 1). Ils seraient responsables d’une activation de la kinase ALK similaire à celle issue des variants EML4-ALK, avec une sensibilité potentielle aux inhibiteurs d’ALK.

Ces réarrangements sont responsables d’une activité tyrosine kinase permanente via la dimérisation du domaine TK, indépendante de toute fixation à un ligand ; cette activation constante est responsable de la prolifération des cellules tumorales, de changements dans leur cytosquelette, de leur migration et de leur survie. Les cellules qui présentent ce réarrangement sont dépendantes de l’activation de la kinase ALK

Recherche des translocations IHC Mise en évidence d’une expression aberrante du domaine kinase intra-cytoplasmique FISH Mise en évidence directe du réarrangement RT-PCR Détection des différents transcrits de fusion grâce à l’utilisation d’amorces spécifiques La mise en évidence d’un réarrangement d’ALK dans les cellules tumorales peut être effectuée par différentes méthodes : l’immunohistochimie met en évidence une expression aberrante du domaine kinase intracytoplasmique de la protéine, la RT-PCR permet la détection des différents transcrits de fusion grâce à l’utilisation d’amorces spécifiques, et les techniques d’hybridation in situ permettent la mise en évidence directe du réarrangement.

D5F3 VENTANA SUR BENSHMARK Recommandé par FDA ET AMM Intérêts Meilleurs prédicateurs de la réponse au traitement par les inhibiteurs spécifique de TK Inconvénients très cher (ac+Systeme d’amplification +Lame temoin) Disponibilité SAV PRIX FINAL PAYE PAR LE PATIENT ?

VALIDATION EQAS EN COURS LEICA/NOVOCASTRA BIOCARE (systeme d amplification ) Bon Technique manuelle Pas de lame témoin Rapport qualité /PRIX VALIDATION EQAS EN COURS

Les tests Alk ihc sont validés et standardisés et sont des outils cliniques pour un dépistage rentable de la présence du réarrangement olk dans le NSCLC et sont déjà recommandés par des organisations en europe, au japon et en asie Aux États-Unis, le test IHC CDX a été approuvé Pour améliorer la fiabilité des tests de détection de la positivité aigüe ainsi que les informations optimales concernant la sélection des patients pour l'inhibiteur alk, d'autres études doivent être effectuées pour comparer et valider ces différents diagnostics. dosages correspondant à la réponse aux inhibiteurs alk avec des programmes externes d'évaluation de la qualité appropriés

GOLD STANDARD VYSIS ABBOT CHALLENGE D’interpretation Validation technique

ETAPE PRE ANALYTIQUE/TECHNIQUE

Profil du signal négatif

Profil du signal positif

Pour chaque cellule préciser le pattern : fusion, split, 5' ou 3' et compter le nombre des cellules ayant chacun des patterns Où les cellules positives sont le nombre de pattern split plus nombre pattern isolé 3’ Un échantillon est considéré : Positif si % >50 (25 cellules sur 50) ; négatif si %<10 (moins de 5 cellules sur 50); équivoque si 10 ≤ % ≤ 50 (5 à 25 cellules sont positives) Si le cas est équivoque, un 2ème lecteur est nécessaire. Analyser 50 cellules puis additionner les deux scores : positif si le % ≥ 15 ou égal négatif si le % <15

VALIDE PLAN B COMPLEMENTAIRE A L IHC ADOPTE PAR CFDA KIT AMODYX : EGFR /ALK/ROS 1 ALK/ROS 1 EGFR :Plateforme Rt –pcr opérationnelle Idylla Kit amodyx egfr alk/ROS 1 (procedure d enregistrment) Prix+++++

Rt-pcr pour les gènes de fusion est un outil de criblage à haut débit avec un temps d'exécution rapide fournissant les informations les plus robustes et détaillées sur les partenaires et les modèles de fusion. Cependant, cette technique est incapable d'identifier les réarrangements impliquant des partenaires de fusion inconnus. ce qui est souvent difficile à obtenir en pratique clinique. Pour surmonter la limitation, rt-pcr quantitatif comparatif a été développé et a été rapporté comme méthode cliniquement faisable. Bien que rt-pcr ait été appliqué à cette technique, NGS la remplace rapidement et devrait devenir une méthode majeure de test moléculaire en pratique clinique.

D5F3 IHC contre FISH IHC avec le clone d5f3 a été comparé à FISH dans au moins 12 études. La sensibilité variait de 81% à 100% et la spécificité de 82% à 100%. Dans une étude dans laquelle un panel international de pathologistes a évalué la d5f3hcc dans une série d'adénocarcinomes pulmonaires avec un génotype alk connu, la concordance inter-observateur dans la notation était élevée. 5a4 ihc versus FISH De nombreuses études ont comparé la HCh avec le clone 5a4 et le FISH en grandes séries. Dans toutes les études, la sensibilité et la spécificité de l'anticorps 5a4 versus FISH ont varié respectivement de 93% à 100% et de 96% à 100%

Conclusion TESTING ALK : GOLD STANDARD dans le CBP NPC non malpighien, Les 2 tests valides sont l'IHC et FISH sur prélèvements tissulaires (biopsies) Recherche de translocations ALK recommandée et systématique ROS ne fait pas, à l'heure actuelle, partie des biomarqueurs émergents selon l'INCa, mais il s'agit d'une cible intéressante

MERCI