INSERTION DU GENE GFP DANS DES BACTERIES GROUPE III Camille Roger, Emma Castel, Daniela Camargo, Kelly Blasco, Sandrine Rivrain, Christophe Le Gros, Laurent Esnault, Boris Guédel, Ciprian Davidescu.
I. Transformation Objectifs : ajout du plasmide contenant le gène GFP à une bactérie. bactérie Gène codant pour la GFP Gène de résistance à la Kanamycine ADN plasmidique
II. Ensemencement Témoins Échantillons Objectifs : culture de bactéries transformées et non transformées. L'échantillon T absence de colonies sur milieu avec Kana. Ne correspond pas au témoin. Conclusion : problème au niveau de la transformation. Transformation des bactéries à refaire. T+K + IPTG T NT+K NT
Deuxième culture bactérienne Témoins Echantillons T+IPTG+K T+IPTG Conclusion : expérience réussie. Les bactéries que nous souhaitions transformer se sont développées dans un milieu avec kanamycine, elles ont incorporé le plasmide : transformation réussie. T+IPTG T+K NT+K NT
III. Isolation et purification du plasmide Objectifs : récupération du plasmide présent dans les bactéries transformées.
IV. Double digestion Objectifs : séparation du gène GFP de l’ADN plasmidique. On effectue cette séparation grâce aux enzymes Hind III et Bam H1. gène de résistance à la Kanamycine
V. Électrophorèse Objectifs : vérification de la présence du gène de la GFP dans le plasmide et du fonctionnement des enzymes. Principes: Le gel d’agarose permet de différencier les fragments d’ADN selon leur taille.
Résultats de la première l’électrophorèse Plasmide digéré Plasmide non digéré Bactéries non transformées Marqueur de poids moléculaire
Résultats de la seconde électrophorèse Marqueur de poids moléculaire H B H B H B B HB HB HB HB Gène GFP Simple digestion avec Bam H1 Simple digestion avec Hind III Double digestion